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含羞草liu

新虫 (小有名气)

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[求助] DH5a感受态细胞制备问题

大家好！我是第一次制备DH5a感受态，为了克隆测序使用。因为我们实验室之前没有人做过，所以在制备过程中出现了问题，想向大家请教。

我是从生工买回的大肠杆菌DH5a菌株，放于－20度保存。我先配制了LB固体和液体培养基，高压灭菌20min。灭菌结束立即将LB固体培养基倒入平板内，待其凝固后，用灭菌牙签将DH5a菌株接种到平板上（分区划线），然后置于37度烘箱过夜培养，约24小时，取出，发现已长出菌落。然后在用灭菌牙签挑取DH5a单菌落于5ml液体培养基（50ml的三角瓶装）中，然后置于摇床上培养过夜，37度，200rpm，约12小时后，取出，发现菌液出现明显的浑浊。然后，我用移液枪吸取菌液1ml放入100ml的液体LB培养基（250ml三角瓶装），然后放入摇床（37度，200rpm），3小时左右，取出一瓶测其OD600值，发现只有0.05左右，延长摇床培养时间，甚至到24小时~48小时，取出测OD600，OD600值也只是达到1点几，怎么也不会达到0.5。关于接种的整个过程都是在超净工作台上进行的，不知道出现这样的结果是什么问题。我已经作了很多次尝试，每次都是OD600达不到要求。

遇到这个问题，我真的很着急，因为等着克隆测序，所以想请大家帮忙指点迷津！感激不尽！！！

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【原创】酶切连接转化个人经验，希望对大家有帮助已经有67人回复

努力，奋斗，拼搏。。。

1楼 2012-07-21 20:54:41

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含羞草liu

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引用回帖:

5楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-07-22 15:56:55
"我用移液枪吸取菌液1ml放入100ml的液体LB培养基（250ml三角瓶装）", 250mL的瓶子最多装50mL就够了，多了通气不好菌就长不起来~~~你装了100mL，所以才长得特别慢~~

补充一下，划线平板上的单菌落很多，没有全部移入液体培养基中，剩下的菌能保存下次使用吗？如果可以的话，怎么保存呢？是直接放在超净工作台中，还是放在4度冰箱？还有，配制好、灭过菌的固体或液体培养基没有使用完，也可以保存吗？4度冰箱保存行吗？