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yesucao

木虫 (正式写手)

[交流] 电击转化

目前实验需求，要求采用电击法转化10.2kb质粒到枯草芽孢杆菌中，实验室没人做过，质粒有点大，知道有难度，所以特来取经，不知道有什么需要注意的地方吗？？？还请各位大虾帮忙！！
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1楼 2011-09-10 15:20:57
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yesucao

木虫 (正式写手)
还想请问一下大家，枯草芽孢杆菌感受态制备，是先制备一些加30%甘油放入-80度冰箱  还是做电击转化的时候现制备啊？？？
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2楼2011-09-10 15:38:09
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cdl007

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+4): 辛苦！ 2011-09-10 17:17:08
amisking(MolEPI+1): 2011-09-10 23:12:19
yesucao(金币+5): 谢谢你给的材料，我会认真参考的 2011-09-13 09:45:15
电击时，盐要洗干净，不然电流过大会爆杯

这有个protocol可以参考一下
第一天：
1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养
2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用
3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用

第二天：
4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中
5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时
6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次）
7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）
8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）
9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。
10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液
11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞
12. 离心，弃上清液
13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）
15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml
16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存

转化方法:
1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟
2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟
3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中
4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT
5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中
7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原
8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养
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3楼2011-09-10 16:39:36
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yesucao

木虫 (正式写手)
我还想问你一些问题：
1、        制备感受态悬浮用的水是什么水？？我看的文献是用缓冲液来悬浮细胞，比如蔗糖加甘油或者一些专用的缓冲液？
2、        一次性制备这么多的感受态能放多久？？不是现配现用的吗？？每一次电击前都要制备一次感受态吗？？
3、        转化方法中，加载P1000是什么意思？这个看不懂
4、        我想一次做多个电击转化，电击杯不是要灭菌吗？这样是不是我要一次灭菌几个灭菌杯？？
5、        这个温度怎么是37度？？不是根据自己的受体菌温度来定的吗？？我的是枯草芽孢杆菌，温度是在30度培养最好。
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4楼2011-09-13 09:41:25
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good 2011-09-13 11:56:45
1、制备感受态悬浮用超纯水或甘油等液（超纯水配制）
2、 制备感受态原则上能放很久，半年应该没问题。
3、 加载P1000是PEG？
4、 电击杯用水以及超纯水清洗，无水乙醇，75%乙醇浸泡几次，晾干就好了。无须灭菌
5、  37度复苏培养，根据受体菌温度来定的。
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5楼2011-09-13 10:03:58
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liygmail at 2011-09-13 10:03:58:
1、制备感受态悬浮用超纯水或甘油等液（超纯水配制）
2、 制备感受态原则上能放很久，半年应该没问题。
3、 加载P1000是PEG？
4、 电击杯用水以及超纯水清洗，无水乙醇，75%乙醇浸泡几次，晾干就好了。无须灭 ...

实验室没有制备超纯水的仪器，可否用其他的水来代替？？比如双蒸水
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6楼2011-09-14 09:07:24
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
30％的甘油浓度太高了，15％到20％就行了，可以现做现用（不用加甘油），也可以加甘油-80保存半年内用
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7楼2011-09-14 22:00:46
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