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[交流]
电击转化
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| 目前实验需求，要求采用电击法转化10.2kb质粒到枯草芽孢杆菌中，实验室没人做过，质粒有点大，知道有难度，所以特来取经，不知道有什么需要注意的地方吗？？？还请各位大虾帮忙！！ |
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 实验技术、方法交流 | 【分子生物】EPI帖 |
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2楼2011-09-10 15:38:09
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+4): 辛苦！ 2011-09-10 17:17:08
amisking(MolEPI+1): 2011-09-10 23:12:19
yesucao(金币+5): 谢谢你给的材料，我会认真参考的 2011-09-13 09:45:15
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+4): 辛苦！ 2011-09-10 17:17:08
amisking(MolEPI+1): 2011-09-10 23:12:19
yesucao(金币+5): 谢谢你给的材料，我会认真参考的 2011-09-13 09:45:15
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电击时，盐要洗干净，不然电流过大会爆杯 这有个protocol可以参考一下 第一天： 1. 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养 2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用 3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天： 4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时） 8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天） 9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液 11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12. 离心，弃上清液 13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散） 15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中 4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 |
3楼2011-09-10 16:39:36
4楼2011-09-13 09:41:25
5楼2011-09-13 10:03:58
6楼2011-09-14 09:07:24
7楼2011-09-14 22:00:46