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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » rt-qPCR(one step)标曲问题
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gaoyu_1984

金虫 (小有名气)

[求助] rt-qPCR(one step)标曲问题

大家好，还是rt-qpcr的问题，之前来发过一次贴，详见http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5474355。但是到现在还没解决，处于极度不知道怎么办的状态。还请各位高手指点一二。问题如下：
标曲RNA样品(最高total RNA浓度约为90ng/uL，10倍数量级稀释5个梯度)，之前一切正常（同样的方法同一批标样至少使用了一年以上），前段时间突然开始最低那个浓度梯度不能扩增，后来迅速发展为倒数第二个也不能扩增，标曲只剩下了3个点，现在第三个浓度低度开始扩增的循环数也推后了……以为是RNA降解了，于是重新制作了标样，可最低两个浓度还是不能正确有效扩增。
于是又考虑probe，primer，RNase free water污染等原因，全部使用了新的，结果还是一样。然后又用了新kit，全部使用了带滤膜的枪头，可还是一样。
后来又考虑到是不是这一批kit的酶有问题，但是奇怪的是同一个标样，同样的稀释方法，其他的功能基因片段可以正确扩增。而一直不能扩增的是当做参考基因β-actin啊~~~~
另外，还想询问下是不是被Rnase污染的可能？目前最高两个浓度开始扩增和达到plateau的循环数同没出现问题一样，污染了话，可能出现这样的情况吗？

还请明白人指点一下那里可能出了问题。

kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen)
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1楼 2013-03-07 15:53:46
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的前三个梯度Ct值分别是多少啊？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-03-07 17:21:07
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gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-07 17:21:07
你的前三个梯度Ct值分别是多少啊？

现在是18.87、21.94、27.17；之前标曲各稀释浓度梯度都能出来的时候是17.5、20.44、23.91、28.28、31.62.
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3楼2013-03-08 09:42:33
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foreverlukel

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
gaoyu_1984(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 11:58:56
如果你想确定是不是RNA酶的污染，可以做一下RNA的保温试验。
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4楼2013-04-16 16:37:45
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coo.coo

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

有没有考虑是run的程序设置问题？
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5楼2013-04-18 12:40:39
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coo.coo

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我想知道你做的是10倍的连续梯度稀释吗？如果是10倍的话，你这条标曲的CT值就感觉不正常了，不能用来定量
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6楼2013-05-10 13:04:08
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