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rt-qPCR(one step)标曲问题
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大家好，还是rt-qpcr的问题，之前来发过一次贴，详见http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5474355。但是到现在还没解决，处于极度不知道怎么办的状态。还请各位高手指点一二。问题如下： 标曲RNA样品(最高total RNA浓度约为90ng/uL，10倍数量级稀释5个梯度)，之前一切正常（同样的方法同一批标样至少使用了一年以上），前段时间突然开始最低那个浓度梯度不能扩增，后来迅速发展为倒数第二个也不能扩增，标曲只剩下了3个点，现在第三个浓度低度开始扩增的循环数也推后了……以为是RNA降解了，于是重新制作了标样，可最低两个浓度还是不能正确有效扩增。 于是又考虑probe，primer，RNase free water污染等原因，全部使用了新的，结果还是一样。然后又用了新kit，全部使用了带滤膜的枪头，可还是一样。 后来又考虑到是不是这一批kit的酶有问题，但是奇怪的是同一个标样，同样的稀释方法，其他的功能基因片段可以正确扩增。而一直不能扩增的是当做参考基因β-actin啊~~~~ 另外，还想询问下是不是被Rnase污染的可能？目前最高两个浓度开始扩增和达到plateau的循环数同没出现问题一样，污染了话，可能出现这样的情况吗？ 还请明白人指点一下那里可能出了问题。 kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen) |
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