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liusiapril

木虫 (小有名气)

[求助] WB没有条带啊

今天做了一次WB。用的蛋白和抗体在此之前试着做过一次DOT BLOT，把抗体的使用条件都摸索了一遍，且取得了较好的结果。但是相同的抗体和蛋白一起来做WB，显影时一条条带也看不到。蛋白上样量比以前还增加了。我在想是转膜的问题吗？我的目的条带最大100kD，最小17kD,0.45的膜湿转，100mA,2小时。求助经验人士给予指导，谢谢
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1楼 2013-03-05 21:09:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liusiapril: 金币+1 2013-03-06 08:37:17
如果怀疑是转膜的问题，可以跑预染的marker，看看marker转的情况。或者转完膜后用丽春红染一下膜看看。
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2楼2013-03-06 07:33:04
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liusiapril

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:33:04
如果怀疑是转膜的问题，可以跑预染的marker，看看marker转的情况。或者转完膜后用丽春红染一下膜看看。

膜上有72和95两条带，小带有部分在滤纸上有印记。但是大的那个条带在膜上也没有出现，今天试着用丽春红染色看看。
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3楼2013-03-06 08:38:29
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liusiapril: 金币+1 2013-03-06 10:45:32
确定用的膜对了，然后转膜时不要有气泡，抗体孵育的时候不要错了
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4楼2013-03-06 09:36:16
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liusiapril

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zx1984 at 2013-03-06 09:36:16
确定用的膜对了，然后转膜时不要有气泡，抗体孵育的时候不要错了

膜对，转膜时也保证没有气泡，抗体孵育是一抗4℃过夜二抗室温40分钟，都是以前摸索好的条件啊。。。
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5楼2013-03-06 10:45:16
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liusiapril

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:33:04
如果怀疑是转膜的问题，可以跑预染的marker，看看marker转的情况。或者转完膜后用丽春红染一下膜看看。

还想再请教一下，丽春红是不是只能用于转膜后未封闭前的膜染色，我一套流程走下来曝光后发现没有条带再染，似乎没有效果啊，染不上的感觉。。。
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6楼2013-03-06 10:48:32
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liusiapril

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:33:04
如果怀疑是转膜的问题，可以跑预染的marker，看看marker转的情况。或者转完膜后用丽春红染一下膜看看。

还想请教一下，丽春红染色是不是只针对于转膜后封闭前的膜，我这一张曝光后未见条带的膜用丽春红染色后没有效果，什么也没有染上。配方是0.1g丽春红，5ml乙酸，定容至100ml。谢谢
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7楼2013-03-06 10:53:52
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neuralcrest

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liusiapril: 金币+1 2013-03-06 12:15:44
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-03-07 08:05:17
你这个显然是转膜不好, PVDF膜需要用甲醇先活化的,看看'分子克隆指南'上的介绍
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有朋自网上来不亦乐乎
8楼2013-03-06 11:07:05
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liusiapril

木虫 (小有名气)
转膜时也有注意避免有气泡的，膜的活化和平衡也处理了，还有什么原因可能导致转膜出问题吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2013-03-06 12:15:22
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neuralcrest

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
silicare: 金币+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2013-03-08 09:47:15
wizardfan: 管理失误，一般一个帖子只产生一个应助指数 2013-03-09 06:59:46
引用回帖:
9楼: Originally posted by liusiapril at 2013-03-06 12:15:22
转膜时也有注意避免有气泡的，膜的活化和平衡也处理了，还有什么原因可能导致转膜出问题吗？

如果你再想不到有问题,就再作一次,good luck,其实有时候, 一些小问题,根本就注意不到,比方电极反了, 或者膜和胶哪个先放,哪个后放,这你可能都知道,但做的时候,一不小心错了,,再认真做一次
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有朋自网上来不亦乐乎
10楼2013-03-06 12:49:33
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