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大风吹

银虫 (小有名气)

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[交流] co-IP 条带问题

我做co-IP Input IgG 抗目的蛋白三条泳道均出现条带
拿了师姐的一组已知相互作用的蛋白来做也是这种情况
不知道哪里出了问题希望做过的交流讨论一下

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1楼 2012-07-19 13:47:39

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大风吹

银虫 (小有名气)

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★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-19 15:19:16

a）293ET细胞共转染质粒后培养24h，弃掉培养基，PBS洗3遍，用1mL组织裂解缓冲液(PMSF+cocktail)裂解，冰上30min－2h，4℃，12000g离心20min，收集上清液。
b) 预留50μl做input，其余样品加入20μl的proteinG beads预沉淀以除去非特异性吸附的影响，4℃离心2500rpm，3min上清移入新EP管中，平均分为两份，一份加入4微升目的蛋白抗体，一份加入对应的IgG做为对照，4℃摇过夜。
d）加入40μl的proteinG beads，继续摇3h，离心去掉上清。用冷裂解液洗5次，每次2500rpm离心弃上清。
e) 将剩余的裂解液尽量洗干净，加入2×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，离心
准备上样。
裂解液 10mM EDTA 10mM EGTA 25mM Tris 1% NP40

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2楼2012-07-19 14:00:27

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大风吹

银虫 (小有名气)

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怎么没人回复啊上面是我的步骤大家看看哪里有问题哦

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3楼2012-07-20 12:28:58

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大风吹

银虫 (小有名气)

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哎自己顶自己一下吧有同样失败经验的吗我们也可以交流一下啊

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4楼2012-07-20 15:23:13

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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

上个图吧，还有，你目的条带的大小是多少？

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5楼2012-07-21 15:36:22

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大风吹

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蛋白B带有Flag标签用它来WB
第三个孔是加入蛋白A抗体的样品 WB后的条带
条带约在95kd 附近
另外你看我的这个组织裂解液成分有没有问题我用这个处理肝组织没出条带感觉跟蛋白不见了似的 GAPDH也淡淡一条线测蛋白浓度还挺高真是搞不懂

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6楼2012-07-22 15:27:08

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大风吹

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4楼的我贴图了帮忙分析一下吧

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8楼2012-07-23 12:06:13

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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

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被你说糊涂了，一下蛋白B，一下蛋白A...我只看到INPUT和IgG，你IP的样品是上的哪个孔？蛋白B是带Flag的，也就是说你前面的处理过程是描述蛋白B的？那么蛋白A又是干什么的？你这个95kd的条带是用Flag抗体测的？你是说IP用的抗体是针对各个你想检测的蛋白的特异性抗体，然后你在WB中用Flag抗体检测？