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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » co-IP 条带问题
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大风吹

银虫 (小有名气)

[交流] co-IP 条带问题

我做co-IP Input IgG 抗目的蛋白 三条泳道均出现条带
拿了师姐的一组已知相互作用的蛋白来做也是这种情况
不知道哪里出了问题 希望做过的交流讨论一下
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1楼 2012-07-19 13:47:39
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大风吹

银虫 (小有名气)
蛋白B带有Flag标签 用它来WB
第三个孔是加入蛋白A抗体的样品 WB后的条带
条带约在95kd 附近
另外你看我的这个组织裂解液成分有没有问题 我用这个处理肝组织 没出条带 感觉 跟蛋白不见了似的 GAPDH也淡淡一条线 测蛋白浓度还挺高 真是搞不懂
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6楼2012-07-22 15:27:08
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大风吹

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-19 15:19:16
a）293ET细胞共转染质粒后培养24h，弃掉培养基，PBS洗3遍，用1mL组织裂解缓冲液(PMSF+cocktail)裂解，冰上30min－2h，4℃，12000g离心20min，收集上清液。
b) 预留50μl做input，其余样品加入20μl的proteinG beads预沉淀以除去非特异性吸附的影响，4℃离心2500rpm，3min上清移入新EP管中，平均分为两份，一份加入4微升目的蛋白抗体，一份加入对应的IgG做为对照，4℃摇过夜。
d）加入40μl的proteinG beads，继续摇3h，离心去掉上清。用冷裂解液洗5次，每次2500rpm离心弃上清。
e) 将剩余的裂解液尽量洗干净，加入2×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，离心
准备上样。
裂解液 10mM EDTA    10mM EGTA   25mM Tris     1% NP40
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2楼2012-07-19 14:00:27
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大风吹

银虫 (小有名气)
怎么没人回复啊 上面是我的步骤 大家看看哪里有问题哦
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3楼2012-07-20 12:28:58
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大风吹

银虫 (小有名气)
哎 自己顶自己一下吧 有同样失败经验的吗 我们也可以交流一下啊
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4楼2012-07-20 15:23:13
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