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大风吹

银虫 (小有名气)

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[交流] co-IP 条带问题

我做co-IP Input IgG 抗目的蛋白三条泳道均出现条带
拿了师姐的一组已知相互作用的蛋白来做也是这种情况
不知道哪里出了问题希望做过的交流讨论一下

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1楼 2012-07-19 13:47:39

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大风吹

银虫 (小有名气)

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哎自己顶自己一下吧有同样失败经验的吗我们也可以交流一下啊

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4楼2012-07-20 15:23:13

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大风吹

银虫 (小有名气)

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★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-19 15:19:16

a）293ET细胞共转染质粒后培养24h，弃掉培养基，PBS洗3遍，用1mL组织裂解缓冲液(PMSF+cocktail)裂解，冰上30min－2h，4℃，12000g离心20min，收集上清液。
b) 预留50μl做input，其余样品加入20μl的proteinG beads预沉淀以除去非特异性吸附的影响，4℃离心2500rpm，3min上清移入新EP管中，平均分为两份，一份加入4微升目的蛋白抗体，一份加入对应的IgG做为对照，4℃摇过夜。
d）加入40μl的proteinG beads，继续摇3h，离心去掉上清。用冷裂解液洗5次，每次2500rpm离心弃上清。
e) 将剩余的裂解液尽量洗干净，加入2×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，离心
准备上样。
裂解液 10mM EDTA 10mM EGTA 25mM Tris 1% NP40

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2楼2012-07-19 14:00:27

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