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大风吹

银虫 (小有名气)

[交流] co-IP 条带问题

我做co-IP Input IgG 抗目的蛋白 三条泳道均出现条带
拿了师姐的一组已知相互作用的蛋白来做也是这种情况
不知道哪里出了问题 希望做过的交流讨论一下
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1楼 2012-07-19 13:47:39
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大风吹

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-19 15:19:16
a）293ET细胞共转染质粒后培养24h，弃掉培养基，PBS洗3遍，用1mL组织裂解缓冲液(PMSF+cocktail)裂解，冰上30min－2h，4℃，12000g离心20min，收集上清液。
b) 预留50μl做input，其余样品加入20μl的proteinG beads预沉淀以除去非特异性吸附的影响，4℃离心2500rpm，3min上清移入新EP管中，平均分为两份，一份加入4微升目的蛋白抗体，一份加入对应的IgG做为对照，4℃摇过夜。
d）加入40μl的proteinG beads，继续摇3h，离心去掉上清。用冷裂解液洗5次，每次2500rpm离心弃上清。
e) 将剩余的裂解液尽量洗干净，加入2×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，离心
准备上样。
裂解液 10mM EDTA    10mM EGTA   25mM Tris     1% NP40
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2楼2012-07-19 14:00:27
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大风吹

银虫 (小有名气)
怎么没人回复啊 上面是我的步骤 大家看看哪里有问题哦
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3楼2012-07-20 12:28:58
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大风吹

银虫 (小有名气)
哎 自己顶自己一下吧 有同样失败经验的吗 我们也可以交流一下啊
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4楼2012-07-20 15:23:13
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
上个图吧，还有，你目的条带的大小是多少？
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5楼2012-07-21 15:36:22
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大风吹

银虫 (小有名气)
蛋白B带有Flag标签 用它来WB
第三个孔是加入蛋白A抗体的样品 WB后的条带
条带约在95kd 附近
另外你看我的这个组织裂解液成分有没有问题 我用这个处理肝组织 没出条带 感觉 跟蛋白不见了似的 GAPDH也淡淡一条线 测蛋白浓度还挺高 真是搞不懂
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6楼2012-07-22 15:27:08
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大风吹

银虫 (小有名气)
4楼的 我贴图了 帮忙分析一下吧
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8楼2012-07-23 12:06:13
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
被你说糊涂了，一下蛋白B，一下蛋白A...我只看到INPUT和IgG，你IP的样品是上的哪个孔？蛋白B是带Flag的，也就是说你前面的处理过程是描述蛋白B的？那么蛋白A又是干什么的？你这个95kd的条带是用Flag抗体测的？你是说IP用的抗体是针对各个你想检测的蛋白的特异性抗体，然后你在WB中用Flag抗体检测？
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9楼2012-07-27 13:25:40
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574426518

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
第一你这个不是CO-IP，最多是IP。
第二上个图。
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10楼2015-06-18 11:39:30
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萝卜涨价了

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
恩，楼主这个是用目的蛋白抗体去吊目的蛋白的吧，这个应该算是IP不算是CO-IP。恩。。CO-IP应该是诱饵蛋白和目的蛋白结合，再用诱饵蛋白的抗体去吊诱饵蛋白。具体的，楼主可以自行到“IP与CO-IP区别”这个网页看看。
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11楼2018-05-04 09:45:48
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简单回复
yxu19867楼
2012-07-22 16:48   回复  
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