24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

大风吹

银虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 267.6
帖子: 122
在线: 59.2小时
虫号: 1319575

[交流] co-IP 条带问题

我做co-IP Input IgG 抗目的蛋白三条泳道均出现条带
拿了师姐的一组已知相互作用的蛋白来做也是这种情况
不知道哪里出了问题希望做过的交流讨论一下

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

求助，关于CO-IP的一些问题！！已经有5人回复
【分享】[03-10]精挑细选绿色软件推荐下载[清清心整理]【已搜索无重复】已经有3人回复
【分享】[07-27]绿色免费精品软件下载[清清心整理]【已搜索无重复】已经有3人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2012-07-19 13:47:39

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

MolEPI: 2
应助: 9 (幼儿园)
金币: 5132.8
帖子: 446
在线: 561.5小时
虫号: 877127

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

被你说糊涂了，一下蛋白B，一下蛋白A...我只看到INPUT和IgG，你IP的样品是上的哪个孔？蛋白B是带Flag的，也就是说你前面的处理过程是描述蛋白B的？那么蛋白A又是干什么的？你这个95kd的条带是用Flag抗体测的？你是说IP用的抗体是针对各个你想检测的蛋白的特异性抗体，然后你在WB中用Flag抗体检测？

赞一下

回复此楼

9楼2012-07-27 13:25:40

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

查看全部 11 个回答

大风吹

银虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 267.6
帖子: 122
在线: 59.2小时
虫号: 1319575

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-07-19 15:19:16

a）293ET细胞共转染质粒后培养24h，弃掉培养基，PBS洗3遍，用1mL组织裂解缓冲液(PMSF+cocktail)裂解，冰上30min－2h，4℃，12000g离心20min，收集上清液。
b) 预留50μl做input，其余样品加入20μl的proteinG beads预沉淀以除去非特异性吸附的影响，4℃离心2500rpm，3min上清移入新EP管中，平均分为两份，一份加入4微升目的蛋白抗体，一份加入对应的IgG做为对照，4℃摇过夜。
d）加入40μl的proteinG beads，继续摇3h，离心去掉上清。用冷裂解液洗5次，每次2500rpm离心弃上清。
e) 将剩余的裂解液尽量洗干净，加入2×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，离心
准备上样。
裂解液 10mM EDTA 10mM EGTA 25mM Tris 1% NP40

赞一下

回复此楼

2楼2012-07-19 14:00:27

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖