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liusiapril

木虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by neuralcrest at 2013-03-06 12:49:33
如果你再想不到有问题,就再作一次,good luck,其实有时候, 一些小问题,根本就注意不到,比方电极反了, 或者膜和胶哪个先放,哪个后放,这你可能都知道,但做的时候,一不小心错了,,再认真做一次...

样品有限,做得我都心疼了。明天再试试看,不知道转膜条件比如电流时间方面有没有什么改进的意见呢?
11楼2013-03-06 20:13:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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★ ★ ★
liusiapril: 金币+2 2013-03-07 18:42:56
silicare: 金币+1, 谢谢参与 2013-03-08 09:47:34
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7楼: Originally posted by liusiapril at 2013-03-06 10:53:52
还想请教一下,丽春红染色是不是只针对于转膜后封闭前的膜,我这一张曝光后未见条带的膜用丽春红染色后没有效果,什么也没有染上。配方是0.1g丽春红,5ml乙酸,定容至100ml。谢谢...

这个染液的配方是可以的。你上样量是多少μg蛋白?丽春红染色不是特别灵敏,一般可以染出丰度较高的蛋白条带。
12楼2013-03-07 10:06:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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★ ★
wizardfan: 金币+2, 不错的思路 2013-03-08 06:35:02
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3楼: Originally posted by liusiapril at 2013-03-06 08:38:29
膜上有72和95两条带,小带有部分在滤纸上有印记。但是大的那个条带在膜上也没有出现,今天试着用丽春红染色看看。...

除了用丽春红染膜外,你可以染一下转过膜的胶。另外可以多跑一份胶专门染色用。对比一下没有转膜和转过膜的胶,看看蛋白是否留在胶里没转过去。
13楼2013-03-07 10:11:15
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liusiapril

木虫 (小有名气)

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12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 10:06:30
这个染液的配方是可以的。你上样量是多少μg蛋白?丽春红染色不是特别灵敏,一般可以染出丰度较高的蛋白条带。...

总蛋白浓度是10微克,今天试了一下转膜后染色,没染上啊,可能真是量不大。转过的胶一直都有染色,除了最顶端较大的条带,别的都没有了。没有再跑胶单染…样品较难获得,怕浪费了…

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14楼2013-03-07 18:42:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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14楼: Originally posted by liusiapril at 2013-03-07 18:42:07
总蛋白浓度是10微克,今天试了一下转膜后染色,没染上啊,可能真是量不大。转过的胶一直都有染色,除了最顶端较大的条带,别的都没有了。没有再跑胶单染…样品较难获得,怕浪费了…
...

10 μg蛋白的确不算多,李春红染不出来也是有可能的。一般是要把胶染一下看是否是跑胶的问题的。样品实在难得也没办法了。你的目标蛋白多大?不是太小的话一般不会转过。你前面提到的转膜电流什么的,你是湿法还是半干法?
15楼2013-03-08 06:29:56
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liusiapril

木虫 (小有名气)

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15楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 06:29:56
10 μg蛋白的确不算多,李春红染不出来也是有可能的。一般是要把胶染一下看是否是跑胶的问题的。样品实在难得也没办法了。你的目标蛋白多大?不是太小的话一般不会转过。你前面提到的转膜电流什么的,你是湿法还是 ...

我的条带大小差距比较多,大的100,小的17,我都是湿转的,一般恒流100mA,转两小时。用的0.45的膜,感觉小的marker带都不是很清晰…0.22的膜我总觉得背景好高

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16楼2013-03-08 08:07:14
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cicelyzh

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★ ★
liusiapril: 金币+2 2013-03-08 13:11:47
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16楼: Originally posted by liusiapril at 2013-03-08 08:07:14
我的条带大小差距比较多,大的100,小的17,我都是湿转的,一般恒流100mA,转两小时。用的0.45的膜,感觉小的marker带都不是很清晰…0.22的膜我总觉得背景好高
...

不是特别小的蛋白不用0.22的膜,通常用0.45的就很好了。我觉得我湿转都是400mA 1.5-2小时的。不知道你的转膜电流是不是有点小。
17楼2013-03-08 11:11:35
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liusiapril

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17楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 11:11:35
不是特别小的蛋白不用0.22的膜,通常用0.45的就很好了。我觉得我湿转都是400mA 1.5-2小时的。不知道你的转膜电流是不是有点小。...

那请问你的胶是多大浓度?电流的问题我考虑改动一下,昨天15%的胶转膜,100mA,2h,貌似大条带不是很好呢。还想请教下你们蛋白上样的问题,是上样液里只有目的蛋白还是也有其他蛋白,我觉得自己的上样可能真的有点少,条带很弱…

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18楼2013-03-08 13:11:21
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cicelyzh

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★ ★ ★
liusiapril: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-03-08 22:21:15
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18楼: Originally posted by liusiapril at 2013-03-08 13:11:21
那请问你的胶是多大浓度?电流的问题我考虑改动一下,昨天15%的胶转膜,100mA,2h,貌似大条带不是很好呢。还想请教下你们蛋白上样的问题,是上样液里只有目的蛋白还是也有其他蛋白,我觉得自己的上样可能真的有点 ...

我一般跑12-20%的梯度胶,有时候也跑12%或者15%的胶。
上的样品有纯化的蛋白,也有蛋白粗提液。就染色而言,一般如果是纯化的样品,不需要上很多,考染1-5μg足够染出很好的带,如果是未纯化的蛋白,上30-50μg。做western的话要根据抗体的效价和目标蛋白在样品中的丰度,如果是纯化过的样品,一般上~10ng就能检测到。
19楼2013-03-08 15:29:34
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liusiapril

木虫 (小有名气)

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19楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 15:29:34
我一般跑12-20%的梯度胶,有时候也跑12%或者15%的胶。
上的样品有纯化的蛋白,也有蛋白粗提液。就染色而言,一般如果是纯化的样品,不需要上很多,考染1-5μg足够染出很好的带,如果是未纯化的蛋白,上30-50μg。 ...

嗯,我的蛋白是天然提取物中获得的,没法纯化,就想通过WB让他们显现出来,方便判断浓度大小。这样看来的话,我的样品上样量很是问题。以前提取这个蛋白,没测浓度前做过一次,那时上了10微升的原液,条带很浓…

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20楼2013-03-08 22:19:32
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