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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大家帮我看看质粒肿木了？
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bubble1220

银虫 (小有名气)

[求助] 大家帮我看看质粒肿木了？

我的质粒大小为2800bp，pUC18复制位点
第一次提取质粒并单酶切验证结果正确，图是这样的
1 质粒
2 单酶切，结果看起来是正确的，下面那条带认为是没有酶切完全的
质粒保存于-20度，2天后再拿出来酶切，结果图是这样的
3 质粒  没什么变成弥散的了？而且带型也和上次不一样了
4 单酶切  结果和上一次一样，但是这回下面那条带我就不认为是没切开的了，因为质粒上也有一条，到底下面那条带是什么啊？

未命名-2.jpg
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1楼 2013-02-26 08:50:37
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回帖置顶 ( 共有1个 )

linzshit

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题 2013-02-26 18:12:23
amisking: 回帖置顶 2013-02-26 18:12:24
bubble1220: 金币+4, ★有帮助 2013-02-28 08:36:02
个人感觉可能是质粒不纯，本身两条带，离的比较近，浓度大的时候不容易被看出来，所以234会在同一个位置留有条带，特别是34，貌似条带的深浅都是一样的。至于为啥弥散，可能是你第一次做的时候，不小心把酶飞进去了，从你的3位置的质粒高度与4位置的酶切高度相当可以推测，以上仅是个人推测。
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7楼2013-02-26 16:37:51
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普通回帖

tianchunying

木虫 (正式写手)
★ ★
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-02-26 18:12:16
从图上看 你的胶应该是没有问题 问题可能出在你酶切那步  你看你2和4两次的结果都不一样 而且一般酶切都能切完全的  建议你加大内切酶的量  延长酶切时间
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
2楼2013-02-26 09:32:12
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tianchunying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
bubble1220: 金币+3, ★有帮助 2013-02-28 08:36:15
从图上看 你的胶应该是没有问题 问题可能出在你酶切那步  你看你2和4两次的结果都不一样 而且一般酶切都能切完全的  建议你加大内切酶的量  延长酶切时间
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
3楼2013-02-26 09:32:28
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bubble1220

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tianchunying at 2013-02-26 09:32:12
从图上看 你的胶应该是没有问题 问题可能出在你酶切那步  你看你2和4两次的结果都不一样 而且一般酶切都能切完全的  建议你加大内切酶的量  延长酶切时间

谢谢，可是我怎么觉得2和4是一样的呢？
我的酶切体系中酶量为十分之一，酶切时间3h,以前都没有问题啊
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4楼2013-02-26 09:34:32
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tianchunying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你2里的质粒加的多，4里的质粒量少，你酶切时间倒是不短，可以再延长到四个小时，内切酶的量加到十分之二试试
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
5楼2013-02-26 09:51:24
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tianchunying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你那个3号 我倒是觉得好奇怪  -20放两天应该没问题啊 不过酶切的东西有的时候就是很奇怪 总之 GOOD LUCK!
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天行健，君子以自强不息；地势坤，君子以厚德载物。
6楼2013-02-26 09:53:48
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你对质粒进行定量。一般鉴定酶切，需要的质粒量一般在500ng--1ug，就足够了，如果需要回收（尤其是回收小片段）时，则一般需要增加酶切的DNA量。
而酶切时，所需要的限制性内切酶的用量，很多人都是凭经验，但事实上，不同的酶，其活性单位定义都不一致。因而，凭经验，很容易出现酶切不完全的情况，我建议你用Doulbe digestion disigner 软件进行双酶切设计，该软件可以根据你酶切的DNA量以及你的限制性内切酶的供应商来精确计算酶切时所需要的酶量，免除优化酶切反应的烦劳。
我们公司购买其使用权，很方便。据说现在还可以免费试用，你可以试试。我在小木虫上推荐过，你应该可以搜到其链接。
祝好运。
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8楼2013-02-26 22:18:09
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
bubble1220: 金币+3, ★有帮助 2013-02-28 08:34:21
一般酶切，20ul体系的话，酶加0.5就够了，当然具体还得看所用商品酶所含酶的单位，一般酶要稀释10倍以上，因为酶液里面所含有的甘油等成分会影响其活性，另外，楼主试试延长酶切时间
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9楼2013-02-27 09:21:31
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damaomao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
10楼2013-02-28 08:56:16
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