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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后连接
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wo_niu

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切后连接

Mlu I 和Xho I 双酶切空载质粒pTRIPZ 和带有shRNAmir片段的GIPZ质粒，之后连接shRNAmir小片段（约345bp）和载体片段（约13kbp）,用的是T4连接酶，16度过夜，但转化后什么都不长，经验证转化没有问题，应该是连接出了问题，请各位大虫赐教如何进行连接。
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1楼 2013-01-18 14:47:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
插入片段和载体分子量相差比较多，所以难连。加大插入片段比例，建议分子数目用10:1或者更高。
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2楼2013-01-18 15:19:54
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wo_niu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-18 15:19:54
插入片段和载体分子量相差比较多，所以难连。加大插入片段比例，建议分子数目用10:1或者更高。

已用过10:1之比例，还是没有哦
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3楼2013-01-18 16:35:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wo_niu: 金币+5, ★有帮助 2013-01-21 12:58:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by wo_niu at 2013-01-18 16:35:23
已用过10:1之比例，还是没有哦...

你确定两个酶都切割完全？xhoI好像切超螺旋质粒比较困难，需要多加酶量。小片段切的酶切位点是否做了足够的保护碱基？这两个酶好像在末端的效率都比较低下，需要切过夜。
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4楼2013-01-19 08:16:16
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