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wo_niu

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切后连接

Mlu I 和Xho I 双酶切空载质粒pTRIPZ 和带有shRNAmir片段的GIPZ质粒,之后连接shRNAmir小片段(约345bp)和载体片段(约13kbp),用的是T4连接酶,16度过夜,但转化后什么都不长,经验证转化没有问题,应该是连接出了问题,请各位大虫赐教如何进行连接。
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
插入片段和载体分子量相差比较多,所以难连。加大插入片段比例,建议分子数目用10:1或者更高。
2楼2013-01-18 15:19:54
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wo_niu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-18 15:19:54
插入片段和载体分子量相差比较多,所以难连。加大插入片段比例,建议分子数目用10:1或者更高。

已用过10:1之比例,还是没有哦
3楼2013-01-18 16:35:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wo_niu: 金币+5, 有帮助 2013-01-21 12:58:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by wo_niu at 2013-01-18 16:35:23
已用过10:1之比例,还是没有哦...

你确定两个酶都切割完全?xhoI好像切超螺旋质粒比较困难,需要多加酶量。小片段切的酶切位点是否做了足够的保护碱基?这两个酶好像在末端的效率都比较低下,需要切过夜。
4楼2013-01-19 08:16:16
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