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1985228

铁虫 (小有名气)


[交流] 有经验的虫友帮我分析下两次western blot 的结果吧,望指点

最近做western blot,抗体买的是博士德公司的一抗和二抗,实验条件转膜之后5%脱脂奶粉室温封闭2h,TBST 5min洗膜一次后;1:150 稀释一抗4度封闭过夜,TBST 洗膜5min,3次;1:3000孵育二抗,TBST 洗膜5min,3次后,ECL曝光拍照。补充:我的膜是NC膜,另外第一次买的一抗说明书上没有写含叠氮化钠;第二次买的时候一抗中含叠氮化钠
第一次的结果如下,有两条带,上面的是目的蛋白,下面比较亮的是内参肌动蛋白
但第二次用同样的抗体,只是不同批次的,买的新抗体,内参基因的条带就非常的淡
请多指点,我现在做了几次试验了,从蛋白也重新提取的

第二次试验结果.jpg
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★
1985228(金币+1): 谢谢参与
1985228: 金币+2 2013-01-17 13:08:19
只看到一张图。
就你描述的问题,你主要的问题是为什么两次做同样的抗体信号有很大强弱差别是吧。
其实这也是可以理解的。首先,实验室做western与公司完全用仪器监控温度、时间等条件控制是不同的,所以即使是同样的抗体每次做也是会有一些差别的。虽然不知道你是如何控制这些条件,但大多数实验室条件下不能比较两次western信号强弱。而且你说的抗体是不同时候买的,难免批次之间也有一定差别。再加上ECL你用的是公司买的吧,即使保存在4°C,效果也不能保证和新买的完全一样。
一般来说是这样,抗体是有一个线性工作范围的,取合适的稀释度后要load不同蛋白量,western暴光后看是否在抗体的线性工作范围。如果蛋白量超出这个范围,信号的衰减或增加与蛋白量变化不成比例,不能用于定量。实际操作上,实验室为了省钱,有些抗体也不是从公司买的,一般是反复使用一抗的。所以确定线性范围很重要。对新的dilution做一下,一般开始使用较少的蛋白,可以延长一抗使用次数。然后再对用过多次的dilution再次确定线性范围,从而确保做的western blot能够做定量分析。
4楼2013-01-17 12:31:20
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userhung

禁虫 (文学泰斗)


3楼2013-01-17 12:25:16
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piaoying_jys

木虫 (著名写手)



1985228(金币+1): 谢谢参与
高手啊
6楼2013-01-17 12:57:37
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1985228

铁虫 (小有名气)


引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-17 12:31:20
只看到一张图。
就你描述的问题,你主要的问题是为什么两次做同样的抗体信号有很大强弱差别是吧。
其实这也是可以理解的。首先,实验室做western与公司完全用仪器监控温度、时间等条件控制是不同的,所以即使是同 ...

谢谢你的宝贵建议了,我QQ514684159,能加QQ吗?我把两次的结果和实验细节发您看看
9楼2013-01-17 13:09:25
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weiwei_l

木虫 (职业作家)



1985228(金币+1): 谢谢参与
楼主加油
10楼2013-01-17 13:11:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


引用回帖:
9楼: Originally posted by 1985228 at 2013-01-17 13:09:25
谢谢你的宝贵建议了,我QQ514684159,能加QQ吗?我把两次的结果和实验细节发您看看...

我不用QQ,发我邮箱cicelyzhang@hotmail.com
11楼2013-01-17 13:36:30
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zhang881007

金虫 (小有名气)



1985228(金币+1): 谢谢参与
首先操作不好,照片显示转移细节注意不够。至少需要清晰背景再来谈。
14楼2013-01-17 15:55:50
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cgf88262楼
2013-01-17 12:24   回复  
1985228(金币+1): 谢谢参与
yaoyao1455楼
2013-01-17 12:55   回复  
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champ7楼
2013-01-17 12:58   回复  
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hxp28008楼
2013-01-17 13:04   回复  
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vgyhn12楼
2013-01-17 13:48   回复  
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seaskyzdw13楼
2013-01-17 13:57   回复  
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