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[交流]
有经验的虫友帮我分析下两次western blot 的结果吧，望指点
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最近做western blot，抗体买的是博士德公司的一抗和二抗，实验条件转膜之后5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST 5min洗膜一次后；1:150 稀释一抗4度封闭过夜，TBST 洗膜5min，3次；1:3000孵育二抗，TBST 洗膜5min，3次后，ECL曝光拍照。补充：我的膜是NC膜，另外第一次买的一抗说明书上没有写含叠氮化钠；第二次买的时候一抗中含叠氮化钠 第一次的结果如下，有两条带，上面的是目的蛋白，下面比较亮的是内参肌动蛋白 但第二次用同样的抗体，只是不同批次的，买的新抗体，内参基因的条带就非常的淡 请多指点，我现在做了几次试验了，从蛋白也重新提取的  第二次试验结果.jpg |
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1985228(金币+1): 谢谢参与
1985228: 金币+2 2013-01-17 13:08:19
1985228(金币+1): 谢谢参与
1985228: 金币+2 2013-01-17 13:08:19
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只看到一张图。 就你描述的问题，你主要的问题是为什么两次做同样的抗体信号有很大强弱差别是吧。 其实这也是可以理解的。首先，实验室做western与公司完全用仪器监控温度、时间等条件控制是不同的，所以即使是同样的抗体每次做也是会有一些差别的。虽然不知道你是如何控制这些条件，但大多数实验室条件下不能比较两次western信号强弱。而且你说的抗体是不同时候买的，难免批次之间也有一定差别。再加上ECL你用的是公司买的吧，即使保存在4°C，效果也不能保证和新买的完全一样。 一般来说是这样，抗体是有一个线性工作范围的，取合适的稀释度后要load不同蛋白量，western暴光后看是否在抗体的线性工作范围。如果蛋白量超出这个范围，信号的衰减或增加与蛋白量变化不成比例，不能用于定量。实际操作上，实验室为了省钱，有些抗体也不是从公司买的，一般是反复使用一抗的。所以确定线性范围很重要。对新的dilution做一下，一般开始使用较少的蛋白，可以延长一抗使用次数。然后再对用过多次的dilution再次确定线性范围，从而确保做的western blot能够做定量分析。 |
4楼2013-01-17 12:31:20
★
1985228(金币+1): 谢谢参与
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3楼2013-01-17 12:25:16
6楼2013-01-17 12:57:37
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11楼2013-01-17 13:36:30
14楼2013-01-17 15:55:50
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cgf88262楼
2013-01-17 12:24
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2013-01-17 12:55
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champ7楼
2013-01-17 12:58
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hxp28008楼
2013-01-17 13:04
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vgyhn12楼
2013-01-17 13:48
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seaskyzdw13楼
2013-01-17 13:57
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