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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有经验的虫友帮我分析下两次western blot 的结果吧，望指点
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1985228

铁虫 (小有名气)

[交流] 有经验的虫友帮我分析下两次western blot 的结果吧，望指点

最近做western blot，抗体买的是博士德公司的一抗和二抗，实验条件转膜之后5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST 5min洗膜一次后；1:150 稀释一抗4度封闭过夜，TBST 洗膜5min，3次；1:3000孵育二抗，TBST 洗膜5min，3次后，ECL曝光拍照。补充：我的膜是NC膜，另外第一次买的一抗说明书上没有写含叠氮化钠；第二次买的时候一抗中含叠氮化钠
第一次的结果如下，有两条带，上面的是目的蛋白，下面比较亮的是内参肌动蛋白
但第二次用同样的抗体，只是不同批次的，买的新抗体，内参基因的条带就非常的淡
请多指点，我现在做了几次试验了，从蛋白也重新提取的

第二次试验结果.jpg
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1楼 2013-01-17 11:57:14
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zhang881007

金虫 (小有名气)
★
1985228(金币+1): 谢谢参与
首先操作不好，照片显示转移细节注意不够。至少需要清晰背景再来谈。
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14楼2013-01-17 15:55:50
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
1985228(金币+1): 谢谢参与
http://www.med66.com/html/ziliao ... e965d5ab47764d4.htm
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4260205
http://www.dxy.cn/bbs/topic/15622038?onlyHost=1
http://www.douban.com/note/136412904/
http://www.dxy.cn/bbs/thread/756765
http://www.ebiotrade.com/newsf/2005-7/2005721122900.htm
http://wenku.baidu.com/view/fda2701dfad6195f312ba650.html
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5026740
http://www.dxy.cn/bbs/topic/9546488
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3楼2013-01-17 12:25:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
1985228(金币+1): 谢谢参与
1985228: 金币+2 2013-01-17 13:08:19
只看到一张图。
就你描述的问题，你主要的问题是为什么两次做同样的抗体信号有很大强弱差别是吧。
其实这也是可以理解的。首先，实验室做western与公司完全用仪器监控温度、时间等条件控制是不同的，所以即使是同样的抗体每次做也是会有一些差别的。虽然不知道你是如何控制这些条件，但大多数实验室条件下不能比较两次western信号强弱。而且你说的抗体是不同时候买的，难免批次之间也有一定差别。再加上ECL你用的是公司买的吧，即使保存在4°C，效果也不能保证和新买的完全一样。
一般来说是这样，抗体是有一个线性工作范围的，取合适的稀释度后要load不同蛋白量，western暴光后看是否在抗体的线性工作范围。如果蛋白量超出这个范围，信号的衰减或增加与蛋白量变化不成比例，不能用于定量。实际操作上，实验室为了省钱，有些抗体也不是从公司买的，一般是反复使用一抗的。所以确定线性范围很重要。对新的dilution做一下，一般开始使用较少的蛋白，可以延长一抗使用次数。然后再对用过多次的dilution再次确定线性范围，从而确保做的western blot能够做定量分析。
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4楼2013-01-17 12:31:20
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1985228

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-17 12:31:20
只看到一张图。
就你描述的问题，你主要的问题是为什么两次做同样的抗体信号有很大强弱差别是吧。
其实这也是可以理解的。首先，实验室做western与公司完全用仪器监控温度、时间等条件控制是不同的，所以即使是同 ...

谢谢你的宝贵建议了，我QQ514684159，能加QQ吗？我把两次的结果和实验细节发您看看
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9楼2013-01-17 13:09:25
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