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ruililian09

银虫 (小有名气)

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[求助] 我的蛋白在大肠杆菌中表达量低怎么办？

我的目的基因约1000bp，用PET-28a载体连接后转化到大肠杆菌BL21中表达。第一次在37℃表达，用0.1~1mMIPTG诱导结果还不错，蛋白基本都在上清中，但表达量也不是很高（见附件中的图）。但是后来又做了几次表达，一样的条件但就是做不出原来的表达量了，不知道是为什么，请各位帮帮忙。我现在在重新提质粒转化，不知道有没有用。要是不行的话，是不是要考虑换载体或者宿主菌什么的？
2012-12-26 37℃诱导5小时.scn(2.77MB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DXbXYx-pUAQA57b?p=130497

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1楼2013-01-06 14:54:28

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linxt2005

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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ruililian09: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2013-01-08 12:32:59

我觉得感受态的好坏只是影响转化效率，对表达的影响应该比较小。

楼主可以从表达条件方面来优化，
1.延长诱导时间，选择合适的IPTG用量；
2.选用合适的温度，比如楼上说的降低温度
3.更换感受态，比如楼上说的用含 pLys S 质粒的。
4.更换培养基，比如TP往往比LB要好些。

从楼主的遇到的情况来看，应该是表达的目的蛋白对宿主菌影响比较大，或者说有毒性，
所以质粒在传代时丢失了，而通过重提质粒转化可以解决。
那么可以通过使用待毒性的宿主菌感受态比如C41等，
或者严格控制表达，比如使用含pLys S质粒的宿主菌，或者诱导前添加适量的葡萄糖，
应该会有效果。
另外，目的蛋白融合标签的方法也能促进表达，但是在这种情况下，往往是因为其影响了目的蛋白的活性，
这个对后期可能会比较麻烦。