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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌RNA提取测得的OD值一直低于1.8
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yly0511

新虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌RNA提取测得的OD值一直低于1.8

如题，请教各位分子生物的专家们，我是食品专业的，没有做过这方面的实验，做了几次提取测得的OD值都是低于1.8，各位能帮忙提点建议可能是什么原因，要怎么解决呢？？多谢多谢啦！！着急呢
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1楼 2012-07-24 21:17:05
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大肠杆菌RNA一般都很好抽提的。用试剂盒就可以，OD低于1.8主要是蛋白没有去干净。
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2楼2012-07-24 22:30:28
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 很热心，很仔细哦 2012-07-25 14:15:47
还是蛋白的问题，是用什么方法提取的呢？
蛋白质是污染RNA 样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA 就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。

Wilcockson利用蛋白质与RNA 在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70%高氯酸钠溶液中，RNA 的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA 能沉淀下来而能溶于70%高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。
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coasttocoast。
3楼2012-07-24 22:34:58
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
现在都用试剂盒提取RNA，去蛋白的效果很好的，提取完毕我个人建议测浓度和用琼脂糖凝胶检测同时进行！会得到更准确的结果
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
4楼2012-07-25 10:46:38
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yly0511

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-07-24 22:30:28
大肠杆菌RNA一般都很好抽提的。用试剂盒就可以，OD低于1.8主要是蛋白没有去干净。

我提取的大肠杆菌RNA是经过微乳液处理过后的，微乳液液体粘度比较大，在离心后不能倾倒的很干净，这方面是不是会有影响呢？
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5楼2012-07-25 12:35:51
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yly0511

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-25 10:46:38
现在都用试剂盒提取RNA，去蛋白的效果很好的，提取完毕我个人建议测浓度和用琼脂糖凝胶检测同时进行！会得到更准确的结果

用试剂盒和用trizol（其他试剂自己配置）会有很大区别吗？
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6楼2012-07-25 12:39:08
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我们这边第一步肯定也是用trizol。菌体经液氮冷冻后碾磨成粉末或用专门的振荡破碎仪破碎菌体后，将少量菌体加入到trizol中，切记菌体量不要太多（1 ml trizol也就加绿豆大小量的菌体），否则会造成后续蛋白去不干净。后续的步骤都用试剂盒了。试剂自己配的话难免出问题，再说试剂盒也不贵。
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7楼2012-07-26 08:20:36
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yly0511

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-07-26 08:20:36
我们这边第一步肯定也是用trizol。菌体经液氮冷冻后碾磨成粉末或用专门的振荡破碎仪破碎菌体后，将少量菌体加入到trizol中，切记菌体量不要太多（1 ml trizol也就加绿豆大小量的菌体），否则会造成后续蛋白去不干净 ...

我处理的时候是将悬浮细菌离心后加入trizol，没有进行液氮研磨，在trizol的说明书里也没有这一步，不知道是不是这不影响？还是就是你说的绿豆大小的菌体是指离心后的还是菌液大小呢？
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8楼2012-07-26 08:59:02
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

是指液氮碾磨后的菌体
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9楼2012-07-26 12:14:10
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mabinbin0209

新虫 (初入文坛)
想请教一下楼主，你后来是否成功提取出了未降解的RNA，我提的总是降解很明显，但是OD都接近于2.0,有时高有时低，但是电泳观察降解很明显
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10楼2015-12-02 20:32:52
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