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ruililian09

银虫 (小有名气)

[求助] 我的蛋白在大肠杆菌中表达量低怎么办?

我的目的基因约1000bp,用PET-28a载体连接后转化到大肠杆菌BL21中表达。第一次在37℃表达,用0.1~1mMIPTG诱导结果还不错,蛋白基本都在上清中,但表达量也不是很高(见附件中的图)。但是后来又做了几次表达,一样的条件但就是做不出原来的表达量了,不知道是为什么,请各位帮帮忙。我现在在重新提质粒转化,不知道有没有用。要是不行的话,是不是要考虑换载体或者宿主菌什么的?
2012-12-26 37℃诱导5小时.scn(2.77MB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DXbXYx-pUAQA57b?p=130497
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ruililian09

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2013-01-06 17:16:17
(1)每次重新转质粒
(2)用PlyS细胞为宿主菌
(3)37度培养至OD0.6后,然后降温到18度,过夜表达

不行,做融合蛋白,这样提高表达量和溶解性。

18度培养不是为了减少包涵体吗,也能提高表达量吗?现在我的蛋白基本都在上清里面,只是总表达量上不去。
4楼2013-01-07 21:41:42
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查看全部 8 个回答

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
ruililian09: 金币+1, 有帮助 2013-01-08 12:33:24
(1)每次重新转质粒
(2)用PlyS细胞为宿主菌
(3)37度培养至OD0.6后,然后降温到18度,过夜表达

不行,做融合蛋白,这样提高表达量和溶解性。
行至水穷处,坐看云起时
2楼2013-01-06 17:16:17
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sdgxz

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
ruililian09: 金币+1, 有帮助 2013-01-08 12:33:31
或者可以尝试一下自诱导
3楼2013-01-07 08:47:19
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ruililian09

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2013-01-06 17:16:17
(1)每次重新转质粒
(2)用PlyS细胞为宿主菌
(3)37度培养至OD0.6后,然后降温到18度,过夜表达

不行,做融合蛋白,这样提高表达量和溶解性。

我前两天重新用质粒转化,再表达了,电泳结果比前两次的好多了,能看出和阴性条带的区别了,但还是没有第一次的结果好。所以我想表达量和BL21的感受态有没有关系,我的感受态好像没有以前好了,质粒转化的阳性菌落也不多,不知道重新做感受态再转化表达会不会得到以前的结果。
5楼2013-01-07 21:44:16
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