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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接检测时双酶切总是切不开
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liudianlei

银虫 (小有名气)

[求助] 连接检测时双酶切总是切不开

目的基因连接到质粒后，转化后的菌做了一个菌落pcr，P出来了，摇菌提质粒，提出来的浓度很低，做双酶切，切出来的只有一条带，不是两条带，大家帮着分析一下是连接没成功还是别的原因？
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1楼 2012-12-28 19:15:04
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ego369

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-28 21:05:47
liudianlei: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-28 21:10:31
是不是转化后的菌对你的酶切位点修饰了，单酶切大小对不？对的话，应该问题不大！看一下是不是酶的问题
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2楼2012-12-28 20:27:48
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liudianlei

银虫 (小有名气)
我没有做单酶切，下一步想做一下单酶切试试，谢谢你的提醒。
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3楼2012-12-28 21:08:36
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liudianlei: 金币+2, ★有帮助 2012-12-28 21:34:37
你这是连在T载体上然后双酶切吗，我估计可能是引物合成的问题，多挑几个克隆试试吧
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2012-12-28 21:24:34
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liudianlei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-28 21:24:34
你这是连在T载体上然后双酶切吗，我估计可能是引物合成的问题，多挑几个克隆试试吧

是的，连接到T载体上，引物我感觉应该是没有问题，我做完连接之后的转化，长得菌很少，可能转化也有问题。
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5楼2012-12-28 21:27:49
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by liudianlei at 2012-12-28 21:27:49
是的，连接到T载体上，引物我感觉应该是没有问题，我做完连接之后的转化，长得菌很少，可能转化也有问题。...

还有你是什么酶切位点，引物是最有可能出问题的，我最近就遭遇了引物合成的问题，浪费我两三天时间
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6楼2012-12-28 21:52:08
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liudianlei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-28 21:52:08
还有你是什么酶切位点，引物是最有可能出问题的，我最近就遭遇了引物合成的问题，浪费我两三天时间...

我是SACI和HINDIII的酶切位点，我的刚才理解错了，我的没有连到T载体上，就是做的普通的连接，用的T4连接酶
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7楼2012-12-28 21:56:26
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
liudianlei: 金币+2, ★有帮助 2012-12-29 19:47:50
引用回帖:
7楼: Originally posted by liudianlei at 2012-12-28 21:56:26
我是SACI和HINDIII的酶切位点，我的刚才理解错了，我的没有连到T载体上，就是做的普通的连接，用的T4连接酶...

切不开，就先连个T载体再酶切试试，SacI和HindIII理论上是很好切的，死活切不开，只能换个法子做
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8楼2012-12-28 22:01:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liudianlei: 金币+2, ★有帮助 2012-12-29 19:47:40
SacI对盐和pH比较敏感。如果提质粒浓度稀而且提的时候用的是缓冲液洗脱的话，在酶切体系中如果加入质粒的体积大可能造成切不开。你可以试试单酶切是否能分别切开。解决这个问题最简单的办法就是同样的质粒用量，加大酶切反应体积。实在不行的话，质粒可以用水洗脱。
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9楼2012-12-29 01:57:33
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liudianlei

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-29 01:57:33
SacI对盐和pH比较敏感。如果提质粒浓度稀而且提的时候用的是缓冲液洗脱的话，在酶切体系中如果加入质粒的体积大可能造成切不开。你可以试试单酶切是否能分别切开。解决这个问题最简单的办法就是同样的质粒用量，加大 ...

谢谢。我试试
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10楼2012-12-29 20:00:12
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