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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接检测时双酶切总是切不开
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liudianlei

银虫 (小有名气)

[求助] 连接检测时双酶切总是切不开

目的基因连接到质粒后，转化后的菌做了一个菌落pcr，P出来了，摇菌提质粒，提出来的浓度很低，做双酶切，切出来的只有一条带，不是两条带，大家帮着分析一下是连接没成功还是别的原因？
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1楼2012-12-28 19:15:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liudianlei: 金币+2, ★有帮助 2012-12-29 19:47:40
SacI对盐和pH比较敏感。如果提质粒浓度稀而且提的时候用的是缓冲液洗脱的话，在酶切体系中如果加入质粒的体积大可能造成切不开。你可以试试单酶切是否能分别切开。解决这个问题最简单的办法就是同样的质粒用量，加大酶切反应体积。实在不行的话，质粒可以用水洗脱。
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9楼2012-12-29 01:57:33
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ego369

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-28 21:05:47
liudianlei: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-28 21:10:31
是不是转化后的菌对你的酶切位点修饰了，单酶切大小对不？对的话，应该问题不大！看一下是不是酶的问题
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2楼2012-12-28 20:27:48
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liudianlei

银虫 (小有名气)
我没有做单酶切，下一步想做一下单酶切试试，谢谢你的提醒。
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3楼2012-12-28 21:08:36
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liudianlei: 金币+2, ★有帮助 2012-12-28 21:34:37
你这是连在T载体上然后双酶切吗，我估计可能是引物合成的问题，多挑几个克隆试试吧
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2012-12-28 21:24:34
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