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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR不出目的条带的原因
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] PCR不出目的条带的原因

各位虫友们，小女子有问题想请教，望大家给出宝贵意见。
为什么PCR同一个基因，同一个模板，换了引物，但每次p出来的条带都在500左右的样子啊？目的条带是2000时，p出来的是500，目的条带是1500时，p出来也还是500，我们排除了引物、模板、酶、buffer等原因，退火温度也尽量低，但为什么还是得不到目的条带呢？
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
1楼2012-12-26 18:07:06
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jimjohntall

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看一下延伸时间是不是改变了。这种情况我认为是引物的问题应该是引物没有设计好，易形成二聚体或者发卡结构引起的
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2楼2012-12-26 18:37:27
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世外清风

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果美女排除了引物、模板、酶、buffer等原因，那么除了水，只有可能是你的引物设计上问题了。建议重新设一对引物扩扩看，同时那一对已知可用的引物扩一下做阳性对照，祝美女实验顺利！
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3楼2012-12-26 18:40:17
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liudianlei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物设计的有问题
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4楼2012-12-26 19:09:32
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-27 16:51:59
哈哈 LZ又开了个新帖子啊 上一帖其实说的都差不多了
问题应该不大 不过在论坛上没有具体信息很难弄清楚
我的建议依然是弄个阳性样品测试，比如这个基因的质粒，确定所有体系都工作，然后再做病人样品，发现大小不一致拿去测序
而且建议LZ请自己组里做分子克隆方面经验丰富的前辈帮你从头梳理解决
或者把关键的引物信息写出来 有时间的虫友可以帮你仔细看看
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5楼2012-12-26 20:03:25
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
5楼: Originally posted by ccharlien at 2012-12-26 20:03:25
哈哈 LZ又开了个新帖子啊 上一帖其实说的都差不多了
问题应该不大 不过在论坛上没有具体信息很难弄清楚
我的建议依然是弄个阳性样品测试，比如这个基因的质粒，确定所有体系都工作，然后再做病人样品，发现大小不 ...

哈哈，比较有心啊你，那你介意我向你详细请教吗？
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
6楼2012-12-26 23:07:01
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
3楼: Originally posted by 世外清风 at 2012-12-26 18:40:17
如果美女排除了引物、模板、酶、buffer等原因，那么除了水，只有可能是你的引物设计上问题了。建议重新设一对引物扩扩看，同时那一对已知可用的引物扩一下做阳性对照，祝美女实验顺利！

谢谢谢谢，但是为什么用别人以前做过的引物扩出来也是500呢？他成功扩出来了是2000
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
7楼2012-12-26 23:08:53
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by wu-ke-da at 2012-12-26 23:08:53
谢谢谢谢，但是为什么用别人以前做过的引物扩出来也是500呢？他成功扩出来了是2000...

那是挺好的结果啊
送去测序看看是不是你要的基因 比对一下
说不定这个样本就是有片段缺失的
你可以短消息我 这几天放假比较有空
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8楼2012-12-26 23:51:05
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virus2009

金虫 (正式写手)

人称 龙哥

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火温度不是越低越好的，你可以考虑摸索一下退火温度，引物单上的Tm降5度，然后上下浮动2-3度进行摸索。找到合适的Tm。
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virus
9楼2012-12-27 09:59:48
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三吉草

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是延伸时间不够啊？大概500bp需要30s吧，2000的话就需要至少2min了！
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10楼2012-12-28 10:06:47
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