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yanbingkun79

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白表达问题

本人做一个大肠杆菌本身酶蛋白的外源表达，具体如下：
将大肠这个目的片段在ecogene中查出，然后设计引物PCR，连到pMD-18T上，转录DH5α中，酶切验证测序全部正确；在连接到pET-28a上，转录BL21（DE3）中，酶切验证测序也全部正确。5-30mM IPTG诱导，20℃、30℃、37℃温度梯度也都设了，还换了宿主细胞Rosetta中，还是不表达。后来换用别人的pET-28a中，也转到BL、rosetta中，表达了一丁丁点点，恳求各位大侠，有什么建设性的建议？纠结死了，做了一个多月了，就是不表达！！！！

[ Last edited by 1949stone on 2012-12-14 at 13:06 ]
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1楼 2012-12-13 22:06:15
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damaomao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
9楼2012-12-15 12:58:47
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
5-30mM IPTG诱导是不是高了点？我是0.2-0.6mM诱导的，表达的很好，37度诱导3个小时，我的蛋白大小为65Kd左右，我的载体也是pET-28a
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-13 23:07:40
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简单HE认真

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的菌诱导后有没有死菌现象？可能是IPTG浓度太大，它也有毒性的，常用浓度是0.1-1.2mM，可以再做尝试看看。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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简单做人，认真做事。
3楼2012-12-13 23:34:59
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你做完破壁看看是不是表达量太大形成了包涵体
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我还年轻，我要上路！
4楼2012-12-14 10:31:45
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