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li1977li

金虫 (小有名气)

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[求助] 蛋白表达纠结啊

最近做克隆表达前面克隆步骤都成功，目的基因大小为1.3kb，最后酶切、测序也没问题，可就是看不到有蛋白表达，载体PET28，宿主菌是rosetta,已试了25℃、0.4mM IPTG，1mM IPTG 的浓度，30℃、1mM IPTG 两种条件，请问有必要再试其它诱导条件如37℃或20 ℃过夜？还是果断的换载体？菌株？还是有其它什么好的办法？盼聆听战友高见！谢谢

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1楼2011-05-30 16:45:01

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yabxxh

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:38
li1977li(金币+1): 2011-05-31 08:37:20

你才试了两个组合就说没有蛋白表达?请问你是怎么判定没有蛋白表达的，sds电泳？是的话你是否分别跑了上清和沉淀？如果都跑了，都没有的话，建议：
1.按照0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2的IPTG浓度分别在30度和37度诱导，诱导时间从1h，2h，3h，4h做梯度，
2.看你的基因是不是表达出毒性蛋白，是的话要选择相应的毒性蛋白表达菌株
3.载体不用换，蛋白表达不是很复杂，但是也不是你想的那么简单，建议多看看《分子克隆第三版》第十五章，希望我没记错。
好运

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2楼2011-05-30 22:03:45

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:49

首先先发表一个不同于楼上的看法：蛋白表达虽操作不复杂，但绝对不简单，每个蛋白都是一个个例。

我们组的一个蛋白做了数百个截短，不同的载体，宿主。大肠、酵母、昆虫等表达系统都试了，N多人投入，N多钱投入，两年了，连可溶性表达都没有获得。

浓度及时间什么的基本可以不试，每次试诱导16、25、37三个温度，都用0.1mM IPTG，没有表达的话基本上就可以不用筛这两个条件了。再筛也不会有什么表达。

不知道你的蛋白含不含稀有密码子，但是我建议你还是多换几个载体，宿主。果断点，别犹豫。换个GST标签的，C端His tag的，BL21试过了么？

毒性不毒性的就不用太在意了，如果毒性能够抑制的话，你能转化成功都是个问题。我碰到过一个双突变的例子，怎么转怎么不长，最后在葡萄糖培养基上长出来的。

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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.