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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:38
li1977li(金币+1): 2011-05-31 08:37:20
你才试了两个组合就说没有蛋白表达?请问你是怎么判定没有蛋白表达的,sds电泳?是的话你是否分别跑了上清和沉淀?如果都跑了,都没有的话,建议:
1.按照0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2的IPTG浓度分别在30度和37度诱导,诱导时间从1h,2h,3h,4h做梯度,
2.看你的基因是不是表达出毒性蛋白,是的话要选择相应的毒性蛋白表达菌株
3.载体不用换,蛋白表达不是很复杂,但是也不是你想的那么简单,建议多看看《分子克隆第三版》第十五章,希望我没记错。
好运
2楼2011-05-30 22:03:45
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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:49
首先先发表一个不同于楼上的看法:蛋白表达虽操作不复杂,但绝对不简单,每个蛋白都是一个个例。

我们组的一个蛋白做了数百个截短,不同的载体,宿主。大肠、酵母、昆虫等表达系统都试了,N多人投入,N多钱投入,两年了,连可溶性表达都没有获得。

浓度及时间什么的基本可以不试,每次试诱导16、25、37三个温度,都用0.1mM IPTG,没有表达的话基本上就可以不用筛这两个条件了。再筛也不会有什么表达。

不知道你的蛋白含不含稀有密码子,但是我建议你还是多换几个载体,宿主。果断点,别犹豫。换个GST标签的,C端His tag的,BL21试过了么?

毒性不毒性的就不用太在意了,如果毒性能够抑制的话,你能转化成功都是个问题。我碰到过一个双突变的例子,怎么转怎么不长,最后在葡萄糖培养基上长出来的。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-05-31 00:42:50
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