| 查看: 1245 | 回复: 4 | |||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
蛋白表达纠结啊
|
|||
| 最近做克隆表达前面克隆步骤都成功，目的基因大小为1.3kb，最后酶切、测序也没问题，可就是看不到有蛋白表达，载体PET28，宿主菌是rosetta,已试了25℃、0.4mM IPTG，1mM IPTG 的浓度，30℃、1mM IPTG 两种条件，请问有必要再试其它诱导条件如37℃或20 ℃过夜？还是果断的换载体？菌株？还是有其它什么好的办法？盼聆听战友高见！谢谢 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有166人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 大肠杆菌超声破碎参数，求解！！！
已经有15人回复
- 串联表达的问题
已经有13人回复
- 大肠杆菌培养及破碎
已经有11人回复
- 蛋白酶基因表达，用的Bacillus subtilis系统，但总是表达不出，求高人指点……
已经有19人回复
- 膜蛋白表达问题
已经有15人回复
- 测序的问题
已经有24人回复
- 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教
已经有18人回复
- 蛋白纯化，纠结
已经有6人回复
- 【求助/交流】做过膜蛋白表达的看过来
已经有12人回复
- 【求助/交流】离子交换纯化原核表达蛋白
已经有15人回复
- 【专题】蛋白新纯化思路探讨
已经有26人回复
- 【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带
已经有41人回复
brightfuture01
木虫之王 (文坛精英)
我爱打老虎
- MolEPI: 14
- 应助: 24 (小学生)
- 贵宾: 1.2
- 金币: 113342
- 散金: 1526
- 红花: 224
- 沙发: 1
- 帖子: 28966
- 在线: 3724小时
- 虫号: 464575
- 注册: 2007-11-21
- 性别: GG
- 专业: 神经生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:49
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:49
|
首先先发表一个不同于楼上的看法：蛋白表达虽操作不复杂，但绝对不简单，每个蛋白都是一个个例。 我们组的一个蛋白做了数百个截短，不同的载体，宿主。大肠、酵母、昆虫等表达系统都试了，N多人投入，N多钱投入，两年了，连可溶性表达都没有获得。 浓度及时间什么的基本可以不试，每次试诱导16、25、37三个温度，都用0.1mM IPTG，没有表达的话基本上就可以不用筛这两个条件了。再筛也不会有什么表达。 不知道你的蛋白含不含稀有密码子，但是我建议你还是多换几个载体，宿主。果断点，别犹豫。换个GST标签的，C端His tag的，BL21试过了么？ 毒性不毒性的就不用太在意了，如果毒性能够抑制的话，你能转化成功都是个问题。我碰到过一个双突变的例子，怎么转怎么不长，最后在葡萄糖培养基上长出来的。 |
3楼2011-05-31 00:42:50
yabxxh
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 14
- 应助: 22 (小学生)
- 贵宾: 0.005
- 金币: 2238
- 散金: 98
- 红花: 9
- 帖子: 465
- 在线: 88.6小时
- 虫号: 157001
- 注册: 2006-01-05
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:38
li1977li(金币+1): 2011-05-31 08:37:20
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-31 08:15:38
li1977li(金币+1): 2011-05-31 08:37:20
|
你才试了两个组合就说没有蛋白表达?请问你是怎么判定没有蛋白表达的，sds电泳？是的话你是否分别跑了上清和沉淀？如果都跑了，都没有的话，建议： 1.按照0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2的IPTG浓度分别在30度和37度诱导，诱导时间从1h，2h，3h，4h做梯度， 2.看你的基因是不是表达出毒性蛋白，是的话要选择相应的毒性蛋白表达菌株 3.载体不用换，蛋白表达不是很复杂，但是也不是你想的那么简单，建议多看看《分子克隆第三版》第十五章，希望我没记错。 好运 |
2楼2011-05-30 22:03:45
4楼2011-05-31 08:02:17
5楼2011-05-31 08:04:03
20