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yanbingkun79

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白表达问题

本人做一个大肠杆菌本身酶蛋白的外源表达,具体如下:
将大肠这个目的片段在ecogene中查出,然后设计引物PCR,连到pMD-18T上,转录DH5α中,酶切验证测序全部正确;在连接到pET-28a上,转录BL21(DE3)中,酶切验证测序也全部正确。5-30mM IPTG诱导,20℃、30℃、37℃温度梯度也都设了,还换了宿主细胞Rosetta中,还是不表达。后来换用别人的pET-28a中,也转到BL、rosetta中,表达了一丁丁点点,恳求各位大侠,有什么建设性的建议?纠结死了,做了一个多月了,就是不表达!!!!

[ Last edited by 1949stone on 2012-12-14 at 13:06 ]
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yanbingkun79

新虫 (初入文坛)

没有包涵体啊,表达量很少的话,怎么能提高表达量呢?
8楼2012-12-14 15:00:20
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查看全部 15 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
5-30mM IPTG诱导是不是高了点?我是0.2-0.6mM诱导的,表达的很好,37度诱导3个小时,我的蛋白大小为65Kd左右,我的载体也是pET-28a
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-13 23:07:40
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简单HE认真

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的菌诱导后有没有死菌现象?可能是IPTG浓度太大,它也有毒性的,常用浓度是0.1-1.2mM,可以再做尝试看看。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
简单做人,认真做事。
3楼2012-12-13 23:34:59
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转基因猴子

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你做完破壁看看是不是表达量太大形成了包涵体
我还年轻,我要上路!
4楼2012-12-14 10:31:45
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