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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE跑得很难看，请高手分析
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weizhe34

至尊木虫 (职业作家)

[求助] SDS-PAGE跑得很难看，请高手分析

SDS-PAGE跑得很难看，请高手分析：
10%的分离胶，4%的浓缩胶，电压：分离胶120V浓缩胶80V，缓冲液刚配的，在浓缩时没有浓缩成一条线，很粗。请高手分析！
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    • 2012-10-27 19:27:41, 46.43 K

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1楼 2012-10-27 19:27:45
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meihuayi

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确实够难看的，不过我也跑过更难看的。没听说其他办法，你把制胶的buffer全部用新的配制，跑胶buffer换新的吧
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只是在在交流中才能碰撞出火花
2楼2012-10-27 22:09:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流问题 2012-10-28 17:49:09
感觉是胶做的不行，可能样品也没处理好。首先检查制胶缓冲液的pH是否正确，把做胶的所有溶液配好后过滤。你的上样量是多少，体积？上样前是否离心？分离胶凝的速度。如果浓缩不好，可能是浓缩胶Tris pH不对，或者是上样buffer的pH不对，还可能是上样体积过大而浓缩胶过短。
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3楼2012-10-28 03:29:02
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huangguoqing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助 2012-10-28 17:49:43
个人几点建议，仅供参考！
1.分离胶凝固之后，在灌注浓缩胶之前一定要把液封的水尽量的用折过的滤纸吸净；
2.拔梳子的时候两边用力均匀些，不要把胶孔弄的大小不一；
3.电泳的时候前沿指示剂（溴酚蓝）的条带过了浓缩胶后，可适当降低电压到80-90V；
4.第五、第六泳道的样品处理的不好，每次用之前都要沸水浴10min，而且可以适当减少上样量。
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4楼2012-10-28 15:34:06
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rice1007

禁虫 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-29 15:45:36
本帖内容被屏蔽
5楼2012-10-28 22:09:36
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流问题 2012-10-30 16:00:25
简单评价下，你可能配胶的AB出现问题了
胶没好好凝，玻璃板没好好洗干净。。。
然后就是可能你的蛋白量有点大，有的孔可能没有，你MARKER都被你挤得很丑了。。。
最大就是胶没凝好
电泳液的pH有么有调。。。
一项项来吧。。。这个东西就得认真
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6楼2012-10-30 11:09:59
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weizhe34

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-10-30 11:09:59
简单评价下，你可能配胶的AB出现问题了
胶没好好凝，玻璃板没好好洗干净。。。
然后就是可能你的蛋白量有点大，有的孔可能没有，你MARKER都被你挤得很丑了。。。
最大就是胶没凝好
电泳液的pH有么有调。。。
一 ...

你可能配胶的AB出现问题了？？是AP?还是？？？
蛋白不大的只有30KD
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7楼2012-10-30 13:21:33
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by weizhe34 at 2012-10-30 13:21:33
你可能配胶的AB出现问题了？？是AP?还是？？？
蛋白不大的只有30KD
...

我说的蛋白量大，不是说你的蛋白分子量大。。。
AP要是出问题了一般都不凝了。。。
你先重配个100ml的AB试试，
另外，你能把你其他的试剂啥的都保证完全正确么？
还有TRIS的pH，你都测好了么
如果你的胶孔一共10个，你只有4个样的话，加上一个marker,就是5个孔，剩下的最好用LOADING BUFFER+电泳缓冲液补充到上样体积，10个孔一起跑，就不会出现泳道不直了。。。
多试试就好了。。。呵呵
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8楼2012-10-30 18:05:58
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weizhe34

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-10-30 18:05:58
我说的蛋白量大，不是说你的蛋白分子量大。。。
AP要是出问题了一般都不凝了。。。
你先重配个100ml的AB试试，
另外，你能把你其他的试剂啥的都保证完全正确么？
还有TRIS的pH，你都测好了么
如果你的胶孔一共 ...

你说的你先重配个100ml的AB是指什么？AB？？？？
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9楼2012-10-30 18:46:57
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yunocn

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人感觉
1，中间2个上样量太大，减少一半吧
2，感觉胶没凝好，所以浓度有点不均匀
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10楼2012-10-31 17:52:17
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