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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 非还原性SDS-PAGE验证二硫键存在分析，请高人指点
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zk0604

木虫 (正式写手)

[求助] 非还原性SDS-PAGE验证二硫键存在分析，请高人指点

为了验证我的蛋白通过二硫键形成了二聚体，我取同一管蛋白分别加入含DDT的loading buffer 和 不含DDT的loading buffer中煮沸处理再跑SDS-PAGE。结果如图，无DDT处理组在大分子量处出现了一条带，可以认为是二聚体，但在最下面又出现一条小带不知道该怎么理解（如红箭头所示）。如果是降解的话左边的对照组应该也会有。大家能不能帮忙分析一下，不胜感激！！！
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1楼 2012-06-29 09:56:32
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zk0604: 金币+1 2012-06-29 14:31:56
amisking: 金币+2, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-06-29 18:24:00
你这是非变性胶么？SDS不是会破坏多聚体么，跑出来的应该都是单体啊。还有，很多二聚体并不一定是以二硫键形式形成的，所以，你就算知道是二聚体，你也不能肯定是有二硫键啊。
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2楼2012-06-29 13:43:38
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zk0604

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-06-29 13:43:38
你这是非变性胶么？SDS不是会破坏多聚体么，跑出来的应该都是单体啊。还有，很多二聚体并不一定是以二硫键形式形成的，所以，你就算知道是二聚体，你也不能肯定是有二硫键啊。

这是变性胶，不是native page. 那两个孔道所用的loading buffer中都有SDS，只有一个区别那就是右边的没加还原剂DDT，从结果上看应该可以认为是二硫键在起作用吧？
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3楼2012-06-29 14:31:15
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zk0604 at 2012-06-29 14:31:15
这是变性胶，不是native page. 那两个孔道所用的loading buffer中都有SDS，只有一个区别那就是右边的没加还原剂DDT，从结果上看应该可以认为是二硫键在起作用吧？...

说SDS不能破坏，但是DTT能还原，说实话二硫键有这特性，其他的我想不到了。但是你这胶跑的也，marker怎么能跑成这样，甘氨酸缓冲液好久没换了？
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4楼2012-06-29 14:36:10
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zk0604

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-06-29 14:36:10
说SDS不能破坏，但是DTT能还原，说实话二硫键有这特性，其他的我想不到了。但是你这胶跑的也，marker怎么能跑成这样，甘氨酸缓冲液好久没换了？...

负极液用了几次的，不过放文章上应该没有什么影响。只是没有办法解释多出的一条带啊
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5楼2012-06-29 15:18:50
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by zk0604 at 2012-06-29 15:18:50
负极液用了几次的，不过放文章上应该没有什么影响。只是没有办法解释多出的一条带啊...

重跑试试？有时候也是胶的问题
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6楼2012-06-29 15:24:55
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fallmonkey

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zk0604: 金币+5, ★有帮助 2012-06-29 21:10:43
zk0604: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-07-01 11:46:56
你不加ddt的下面两条带很可能是形成二硫键的两个亚基从其他位置断开了，形成了一个大一些、一个小一些的单体。建议考察一下你蛋白里面一级结构里面，序列有没有温度敏感的序列（猜测）。
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7楼2012-06-29 18:19:12
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flyy1986

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zk0604: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-06-30 10:21:18
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-11 13:35:57
建议重新来过一次以保证实验的准确度。这里提出我的经验和推测。如果蛋白质分子内存在二硫键和蛋白质分子内无二硫键的电泳迁移率存在差异。虽然差异不大，但可以肉眼可分辨了。这种解释用来监控蛋白质折叠，貌似也可以符合你的实验结果。无DTT样品中存在可能至少三种二硫键状况的分子。不过建议重来。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2012-06-30 08:07:10
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zk0604

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by flyy1986 at 2012-06-30 08:07:10
建议重新来过一次以保证实验的准确度。这里提出我的经验和推测。如果蛋白质分子内存在二硫键和蛋白质分子内无二硫键的电泳迁移率存在差异。虽然差异不大，但可以肉眼可分辨了。这种解释用来监控蛋白质折叠，貌似也可 ...

谢谢，之前我有重复过，但那边还是会多出一条带的。。
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9楼2012-06-30 10:20:59
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zk0604

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by flyy1986 at 2012-06-30 08:07:10
建议重新来过一次以保证实验的准确度。这里提出我的经验和推测。如果蛋白质分子内存在二硫键和蛋白质分子内无二硫键的电泳迁移率存在差异。虽然差异不大，但可以肉眼可分辨了。这种解释用来监控蛋白质折叠，貌似也可 ...

我没有把无二硫键的野生蛋白图弄出来，那个跑胶只有一条带，而且与存在二硫键的蛋白质分子加DDT煮沸跑胶的电泳迁移一致。我估计只能用结构差异来解释了
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10楼2012-06-30 10:25:27
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