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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SYBR荧光定量扩增曲线异常
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dzxy7678

铁虫 (小有名气)

[求助] SYBR荧光定量扩增曲线异常

扩增曲线从左到右浓度依次降低，5倍稀释，熔解曲线中，有2个峰的是浓度最高的，请问，浓度最高的怎么跑成这样？
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    • 2012-09-14 20:05:10, 1.29 M
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1楼 2012-09-14 20:10:30
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
嗯......................
       个人意见，如果系列稀释中最高浓度样品出现扩增不正常的现象，往往是指你样品中有PCR抑制物残留，可能是样品提取中有杂质残存，如果是RNA反转录过程，不正确的RT步骤也会有影响。随着你稀释的过程，抑制物浓度也会被稀释到不影响PCR反应的程度，随后的几个样品扩增也就正常化了~
       如果有说错请其他高手指点，若你之后实验解决了这个问题，也请告知我
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Let God do with it as He wills
2楼2012-09-15 11:02:40
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dzxy7678

铁虫 (小有名气)
谢谢，如何补救呢？
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-16 10:05:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 很久没来了，辛苦 2012-09-17 16:44:39
引用回帖:
3楼: Originally posted by dzxy7678 at 2012-09-16 10:05:49
谢谢，如何补救呢？

嗯................
       补救有几个方法：
       1. 重新提，并注意洗涤步骤，乙醇洗两次左右。如果是RNA的话，分光光度测量时注意260/230比值，不要低于1，低于1的话，盐类杂质太多肯定是干扰PCR进程的。
       2. 做标曲好像是可以把头尾的误差较大的点去掉的，多做几个梯度，以6~7个为宜，若除去原液的其他稀释样品都能成线性，且斜率接近-3.32，就不要原液这个点了，用之后的6个点做标曲，但注意，若中间有点误差太大的话是不能去掉的。必须重做。同时你最后待测样品也一定要落在除掉原点后的6个点的线性范围内。
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
4楼2012-09-16 12:36:55
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