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求助！大肠杆菌转化不长菌落~
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我做的是空载体的大肠杆菌转化，然后挑单菌落提取质粒。 现在已经做了三次，但是都没有出结果~ 材料如下： 空载体是5微升质粒干粉加进40微升Eluent（Eluent是Takala公司质粒提取试剂盒中的）稀释，初始浓度为160.5ng/μl，然后分别稀释10倍（测试后浓度为15.0ng/μl）和100倍（7.0ng/μl，应该是浓度太低，测得不精确）。 感受态是Takala的DH5α 具体步骤如下： 1。分别取以上三种各1μl加入到50μl感受态中，冰浴30min，用枪头轻轻混匀。 2。在42℃中放置45s。 3。放入冰浴中2min。 4。在操作台中加入500μlLB培养基无抗体。 5。在30摄氏度培养箱中200转1h。 6。5000rpm/min中离心1min。 7。在无菌操作台中取出上清液450μl，然后剩余的100μl全部涂板（Amp抗性），倒置到37℃培养箱中。 结果：不涨菌落。。 问题： 是不是浓度太大的问题，还是操作步骤有问题，求各位指导 [ Last edited by 1949stone on 2012-8-24 at 17:05 ] |
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几点意见： 1，质粒就用初始浓度的就好了，1μl足够了。不能用枪吹打，用手指轻弹小离心管外壁就行了，混匀之后放置半小时。 2，应该放37度摇床，220rpm差不多，1.5小时。 3，没必要离心，就直接取100μl涂板就行了。有时候太浓密了，会看不到明显菌落，会像没长一样。 4，涂板一定要等玻璃棒冷却，不然会烫死菌的。 5，在培养箱中先正放半小时，再倒置，而且平板要提前半小时预热。 |
6楼2012-08-21 13:20:45
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个人认为你可以修改几个条件 1.适当增加点质粒的量，但不要超过总体的十分之一就好； 2.DH5a感受态热击90s试试； 3.复苏培养的时候培养基改成SOC会好很多； 4.这时候的菌很脆弱，最好把转速降低点，之前有过同学只是放在恒温培养箱里静置就可以的； 5.离心时间可以增长点，比如5min； 6.涂板的时候只要涂布均匀即可，不需要太长时间； 7.涂布之后，最好正面朝上静置几分钟，新平板就时间长点，旧平板就时间短点。 个人意见，仅供参考！ |
2楼2012-08-21 11:54:04
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1、加入质粒的时候，感受态应该是处于冰水混合的状态时是最好的，不要等它全融化了再加； 2、质粒1微升的加入量有点少，可以适当多加点，3-4微升； 3、42度热激90s后，立即冰浴； 4、大肠杆菌摇床是在37度，转速190rpm 1h就可以了； 5、注意或许也有感受态的问题； 6、加入的AMP的浓度是否正确； 7、涂布的时候把液体涂干，不要有水；或者涂布完后打开盖子一点，让风吹干，之后再37度倒置培养。 |
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