| 查看: 7225 | 回复: 28 | |||
[求助]
求助！大肠杆菌转化不长菌落~
|
|||
|
我做的是空载体的大肠杆菌转化，然后挑单菌落提取质粒。 现在已经做了三次，但是都没有出结果~ 材料如下： 空载体是5微升质粒干粉加进40微升Eluent（Eluent是Takala公司质粒提取试剂盒中的）稀释，初始浓度为160.5ng/μl，然后分别稀释10倍（测试后浓度为15.0ng/μl）和100倍（7.0ng/μl，应该是浓度太低，测得不精确）。 感受态是Takala的DH5α 具体步骤如下： 1。分别取以上三种各1μl加入到50μl感受态中，冰浴30min，用枪头轻轻混匀。 2。在42℃中放置45s。 3。放入冰浴中2min。 4。在操作台中加入500μlLB培养基无抗体。 5。在30摄氏度培养箱中200转1h。 6。5000rpm/min中离心1min。 7。在无菌操作台中取出上清液450μl，然后剩余的100μl全部涂板（Amp抗性），倒置到37℃培养箱中。 结果：不涨菌落。。 问题： 是不是浓度太大的问题，还是操作步骤有问题，求各位指导 [ Last edited by 1949stone on 2012-8-24 at 17:05 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有107人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
大肠杆菌转化问题
已经有5人回复- 大肠杆菌菌落形态请教
已经有29人回复
- 大肠杆菌转化时出现异常现象
已经有10人回复
- 大肠杆菌转化求助
已经有3人回复
- 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？
已经有17人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌转化PCR鉴定，没有阳性菌落
已经有5人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌菌液，如何再扩增？
已经有13人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌斜面的白色菌落？
已经有11人回复
- 【求助/交流】质粒转入大肠杆菌怎么都不长啊
已经有11人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌摇菌时长时不长
已经有24人回复
- 【求助/交流】请教细菌菌落平板计数法结果不太理解
已经有17人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌
已经有6人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌感受态污染问题
已经有21人回复
- 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题
已经有23人回复
dshlove
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 17
- 应助: 237 (大学生)
- 金币: 4764.7
- 散金: 20
- 红花: 10
- 帖子: 852
- 在线: 419.2小时
- 虫号: 1609389
- 注册: 2012-02-10
- 性别: GG
- 专业: 污染控制化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助，解答问题 2012-08-21 16:07:45
nongdaylf: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-22 17:44:09
nongdaylf: 金币+15 2012-08-22 20:13:30
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助，解答问题 2012-08-21 16:07:45
nongdaylf: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-22 17:44:09
nongdaylf: 金币+15 2012-08-22 20:13:30
|
几点意见： 1，质粒就用初始浓度的就好了，1μl足够了。不能用枪吹打，用手指轻弹小离心管外壁就行了，混匀之后放置半小时。 2，应该放37度摇床，220rpm差不多，1.5小时。 3，没必要离心，就直接取100μl涂板就行了。有时候太浓密了，会看不到明显菌落，会像没长一样。 4，涂板一定要等玻璃棒冷却，不然会烫死菌的。 5，在培养箱中先正放半小时，再倒置，而且平板要提前半小时预热。 |
6楼2012-08-21 13:20:45
huangguoqing
木虫 (正式写手)
- 应助: 31 (小学生)
- 金币: 3524.6
- 散金: 100
- 红花: 3
- 帖子: 356
- 在线: 305.1小时
- 虫号: 909932
- 注册: 2009-11-22
- 性别: GG
- 专业: 基因组学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极解答问题 2012-08-21 16:06:27
amisking: 回帖置顶 2012-08-21 20:02:27
nongdaylf: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-22 20:12:57
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极解答问题 2012-08-21 16:06:27
amisking: 回帖置顶 2012-08-21 20:02:27
nongdaylf: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-22 20:12:57
|
个人认为你可以修改几个条件 1.适当增加点质粒的量，但不要超过总体的十分之一就好； 2.DH5a感受态热击90s试试； 3.复苏培养的时候培养基改成SOC会好很多； 4.这时候的菌很脆弱，最好把转速降低点，之前有过同学只是放在恒温培养箱里静置就可以的； 5.离心时间可以增长点，比如5min； 6.涂板的时候只要涂布均匀即可，不需要太长时间； 7.涂布之后，最好正面朝上静置几分钟，新平板就时间长点，旧平板就时间短点。 个人意见，仅供参考！ |
2楼2012-08-21 11:54:04
tanglian8655
金虫 (正式写手)
- 应助: 21 (小学生)
- 金币: 1757.7
- 红花: 3
- 帖子: 321
- 在线: 95.5小时
- 虫号: 1523666
- 注册: 2011-12-04
- 性别: MM
- 专业: 药物分析
3楼2012-08-21 12:05:21
yesucao
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 51 (初中生)
- 金币: 3877.1
- 散金: 45
- 红花: 6
- 帖子: 374
- 在线: 203.4小时
- 虫号: 810829
- 注册: 2009-07-17
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极解答问题 2012-08-21 16:07:03
amisking: 回帖置顶 2012-08-21 20:02:32
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极解答问题 2012-08-21 16:07:03
amisking: 回帖置顶 2012-08-21 20:02:32
|
1、加入质粒的时候，感受态应该是处于冰水混合的状态时是最好的，不要等它全融化了再加； 2、质粒1微升的加入量有点少，可以适当多加点，3-4微升； 3、42度热激90s后，立即冰浴； 4、大肠杆菌摇床是在37度，转速190rpm 1h就可以了； 5、注意或许也有感受态的问题； 6、加入的AMP的浓度是否正确； 7、涂布的时候把液体涂干，不要有水；或者涂布完后打开盖子一点，让风吹干，之后再37度倒置培养。 |
4楼2012-08-21 12:43:21
5楼2012-08-21 12:57:00
7楼2012-08-21 14:35:41
8楼2012-08-21 14:35:50
9楼2012-08-21 14:36:01
10楼2012-08-21 14:36:13