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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！大肠杆菌转化不长菌落~
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-22 15:05:56
你看看你的抗性用错没。。。。。。我就干过这种事儿。。。。。。。质粒转化的效率和连接转化相比是灰常灰常高的，基本上我们就用肉眼可见的那么一丁点，浓度并不是很重要，有点就能进去。然后涂板的时候只涂1ul。。。。。就能长满盘，所以你还是检验一下你那个感受态好不好，可以涂空白平板（木有抗生素哦~）。takala的不一定就好用，感受态不是正常的细胞，放时间太长了或者冰箱曾经停电停过不好用了也未可知~~~~~也可以换个新鲜质粒转化下试试~~~~~
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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
21楼2012-08-22 08:02:04
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damaomao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
22楼2012-08-22 15:58:05
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nongdaylf

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 实心小白菜 at 2012-08-22 08:02:04
你看看你的抗性用错没。。。。。。我就干过这种事儿。。。。。。。质粒转化的效率和连接转化相比是灰常灰常高的，基本上我们就用肉眼可见的那么一丁点，浓度并不是很重要，有点就能进去。然后涂板的时候只涂1ul。。 ...

涂板只用1μl？？不少么，那能涂开么。
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小白
23楼2012-08-22 17:40:52
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nongdaylf

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by dshlove at 2012-08-21 16:21:24
那是要在你的感受态转化效率很高的情况下，再说，哪有那么多理想情况啊。不要舍不得质粒啊。...

不是舍不得质粒，我觉得浓度太高的话，容易意志，导致不涨菌。
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小白
24楼2012-08-22 17:42:31
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by nongdaylf at 2012-08-22 17:42:31
不是舍不得质粒，我觉得浓度太高的话，容易意志，导致不涨菌。...

我一般转化，不管是提质粒还是做表达的，基本就拿很高浓度的质粒，基本都是300ng/ul,去转化，取0.5-1ul转化。
当然，感受态批次有时候是不一样的，管与管之间差别有时候很大，我以前也是一管死活转化不了，后来换了几管就又可以了。
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25楼2012-08-23 08:40:52
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
23楼: Originally posted by nongdaylf at 2012-08-22 17:40:52
涂板只用1μl？？不少么，那能涂开么。...

稀释到200ulLB里，反正你也不需要那么多菌落，有几个能挑出来就行，怕不长就用5ul~还是稀释到200LB里涂板
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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
26楼2012-08-24 16:23:32
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werty1245

新虫 (初入文坛)
楼主解决这个问题了吗？我现在也遇到跟你一样的问题

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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27楼2013-09-29 21:39:59
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779653072

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by hutingting at 2012-08-21 15:59:47
热转化，42度热击45s，我以前转的长的都很好，50ul的感受态细胞，加入不超过10ngDNA，体积不超过细胞体积的5%，复苏要在37度，200-250rpm，一个小时足够了，涂板时可以离心去上清，最好做个梯度，我们实验室一般不离 ...

10ng 的质粒，这个质粒应该包括载体和插入片段的吧？如果这样的话做完ligation怎么测定浓度呢？ligation溶液中本来还有很多没有反应的载体和插入片段啊。求教~~~
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28楼2018-02-07 10:51:13
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减肥中的魏镇

新虫 (初入文坛)
之前我也是这种情况，可能是你做agar plate 的时候液体培养基温度太高了就加入抗生素导致没有筛选作用，简直换个板子，同时做划转的时候做个control

发自小木虫IOS客户端
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29楼2018-02-07 18:58:40
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