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nongdaylf

铁虫 (初入文坛)

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专业: 生物化学

[求助] 求助！大肠杆菌转化不长菌落~

我做的是空载体的大肠杆菌转化，然后挑单菌落提取质粒。
现在已经做了三次，但是都没有出结果~
材料如下：
空载体是5微升质粒干粉加进40微升Eluent（Eluent是Takala公司质粒提取试剂盒中的）稀释，初始浓度为160.5ng/μl，然后分别稀释10倍（测试后浓度为15.0ng/μl）和100倍（7.0ng/μl，应该是浓度太低，测得不精确）。
感受态是Takala的DH5α
具体步骤如下：
1。分别取以上三种各1μl加入到50μl感受态中，冰浴30min，用枪头轻轻混匀。
2。在42℃中放置45s。
3。放入冰浴中2min。
4。在操作台中加入500μlLB培养基无抗体。
5。在30摄氏度培养箱中200转1h。
6。5000rpm/min中离心1min。
7。在无菌操作台中取出上清液450μl，然后剩余的100μl全部涂板（Amp抗性），倒置到37℃培养箱中。
结果：不涨菌落。。
问题：
是不是浓度太大的问题，还是操作步骤有问题，求各位指导

[ Last edited by 1949stone on 2012-8-24 at 17:05 ]

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小白

1楼2012-08-21 11:14:58

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助，解答问题 2012-08-21 16:07:45
nongdaylf: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-22 17:44:09
nongdaylf: 金币+15 2012-08-22 20:13:30

几点意见：
1，质粒就用初始浓度的就好了，1μl足够了。不能用枪吹打，用手指轻弹小离心管外壁就行了，混匀之后放置半小时。
2，应该放37度摇床，220rpm差不多，1.5小时。
3，没必要离心，就直接取100μl涂板就行了。有时候太浓密了，会看不到明显菌落，会像没长一样。
4，涂板一定要等玻璃棒冷却，不然会烫死菌的。
5，在培养箱中先正放半小时，再倒置，而且平板要提前半小时预热。