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tanglian8655

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by nongdaylf at 2012-08-21 14:36:13
有人说浓度只要是pg就可以了，是么，还有的说小于10ng，也有的说100ng，应该是多少呢。...

你是指的哪个浓度呢，转化后培养一段时间之后的浓度么
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11楼2012-08-21 14:49:23
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crusoe

木虫 (正式写手)
nongdaylf: 回帖置顶 2012-08-22 17:45:20
引用回帖:
8楼: Originally posted by nongdaylf at 2012-08-21 14:35:50
谢谢，我的平板一点菌都没有涨。
有人说浓度只要是pg就可以了，是么，还有的说小于10ng，也有的说100ng，应该是多少呢。...

化转的话应该是10ng左右吧，电转可以是pg级。
看看你的抗性有没有弄错。
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12楼2012-08-21 15:12:08
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-21 16:08:18
42度热激改为90s，复苏应该在37度。涂板先离心再涂板是没有问题的。不过上清适当丢少一些，最后有300涂板为宜。
个人认为你的步骤中热激时间和复苏温度是最大的问题。
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13楼2012-08-21 15:42:05
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hutingting

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验，积极应助 2012-08-21 16:08:37
热转化，42度热击45s，我以前转的长的都很好，50ul的感受态细胞，加入不超过10ngDNA，体积不超过细胞体积的5%，复苏要在37度，200-250rpm，一个小时足够了，涂板时可以离心去上清，最好做个梯度，我们实验室一般不离心，直接取100ul菌液涂板，希望可以帮到你
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14楼2012-08-21 15:59:47
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450104402

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
验证过你的感受态细胞了吗？还有你的质粒的抗性是什么，会不会搞错
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15楼2012-08-21 16:11:50
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by nongdaylf at 2012-08-21 14:35:41
谢谢，我的平板一点菌都没有涨。
有人说浓度只要是pg就可以了，是么，还有的说小于10ng，也有的说100ng，应该是多少呢。...

那是要在你的感受态转化效率很高的情况下，再说，哪有那么多理想情况啊。不要舍不得质粒啊。
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16楼2012-08-21 16:21:24
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police2009

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by nongdaylf at 2012-08-21 14:35:41
谢谢，我的平板一点菌都没有涨。
有人说浓度只要是pg就可以了，是么，还有的说小于10ng，也有的说100ng，应该是多少呢。...

跟你自己的感受态细胞的效率有关，效率越高需要的越少，一般化学转化的话，1ng会长100个左右吧。
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17楼2012-08-21 16:43:20
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匿名

用户注销 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖仅楼主可见
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18楼2012-08-21 17:17:35
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烟涛微茫

铁杆木虫 (文坛精英)

卡牌大师

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1。加入质粒时，感受态细胞应该是处于冰浴（冰水混合最好），不要等它全融化了再加。
2。42度热激90s后，立即冰浴；
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心之所善，九死未悔
19楼2012-08-21 22:15:38
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:06:22
转化步骤没有大问题，就是第一步加入质粒后混匀后再冰浴。
主要看看你载体是什么抗性，是不是抗性搞错了。
如果还有质粒干粉的话，用双蒸水稀释后取1ul转化试试看。
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20楼2012-08-21 23:54:50
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