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allegro1741

新虫 (小有名气)

[求助] Q-PCR和RT-PCR结果不一致呢？

做了两次定量（Q）-PCR，一个基因的转录量都是降低的，可每次做半定量（RT）-PCR结果又显示升高，这是怎么回事？半定量的cDNA也经过稀释，不存在饱和现象...
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1楼2012-08-13 15:05:27
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woshizhufeng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实时定量PCR和半定量PCR二者的精确度是不一样的，所以不相同很正常啊，半定量PCR的误差比较大，现在也有做的，但用的比较少了。实施荧光定量PCR受cDNA的浓度和质量影响也比较大，所以要保证你的模板质量没有问题。多做几次吧，看趋势就好了。
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4楼2012-08-15 08:54:39
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gl185

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-14 13:49:31
实时定量PCR和半定量PCR结果不相同很正常，毕竟半定量PCR的误差很大，在做半定量的时候，你一定要把内参基因调的，在各个组织中表达量是一样的，这样才能做目的基因。而实时定量PCR就不存在这样的问题，所以我觉得还是你的半定量可能调的cDNA没有调好
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2楼2012-08-14 12:32:09
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主，还需要考虑另外一个问题，做普通RT时用的PCR 成分都是普通的，而Q用的是公司定制的，其BUFFER差异很大，因为公司定的BUFFER我们不知道里面的具体成分，因此，两者结果不一致也正常。再者二者反应条件也不完全一致。
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3楼2012-08-14 19:49:54
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