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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 感受态细胞提取的质粒酶解后为什么带型不一样？
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jackiey2

铜虫 (正式写手)

[交流] 感受态细胞提取的质粒酶解后为什么带型不一样？ 已有7人参与

有个问题始终想不明白
重组质粒带有氨苄抗性基因。重组质粒导入感受态细胞后铺带氨苄的平板，长出来的菌落应该都是成功摄入重组质粒的吧？挑出来若干个单菌落扩大培养后提取质粒，用限制酶进行酶切，为什么切出来的带有的还不一样呢？
新手做分子，望高手解惑，谢谢。

[ Last edited by jackiey2 on 2012-7-30 at 09:16 ]
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遗传
1楼 2012-07-30 08:57:45
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jackiey2

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-30 09:30:07
不知道你说的条带不一样是什么意思，不知道你用的什么酶，质粒中某种酶的酶切位点不止一个，所以有可能切出不同大小的片段

用一种酶（KnoI），查重组质粒图谱，有两个切点。挑十个单菌落，扩大培养提质粒，用KnoI酶切，电泳条带不一样。
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遗传
3楼2012-07-30 15:52:42
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jackiey2

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-30 16:12:45
你是说，你提取的十个质粒，用酶切完之后，跑胶的条带不一致？
这样情况，我建议你先把你的质粒跑胶看看，因为有时候质粒也有可能不纯，导致你后续酶切，条带不一致。...

我的质粒是经过KOD扩增出来的啊。
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遗传
5楼2012-07-30 18:05:59
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jackiey2

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yuliansheng at 2012-08-01 11:55:54
分析
问题点一：你的重组的质粒在导入感受态细胞之前，你能确定你所用的质粒和目的片段都很好的连接了吗？
问题点二：你的重组质粒在连接时，应该会有两种可能的。一是目的片段很好的连接到你所用的质粒上，得到你 ...

我导入感受态的质粒不是酶切后再连接的，是直接用KOD扩增，加点突变的，亲！！
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遗传
9楼2012-08-01 19:15:22
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jackiey2

铜虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-30 20:36:53
通常情况需要做的是蓝白斑筛选，但是楼主只用氨苄的情况，挑取菌落后仍需要用你自己的引物和通用引物进行菌落PCR筛选，筛选正确的克隆才用来培养。不是挑取的所有菌落都是你需要的。

我只是想知道，为什么不是所有的菌落都是我需要的。按理，能在含有抗生素培养基上生长的都是成功摄入质粒的啊。而且我的质粒不是经过连接酶连接的，而是通过高保真酶扩增的。
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遗传
10楼2012-08-01 19:19:25
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