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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胶回收产物连接后片段大小
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ZOEY21

金虫 (小有名气)

[求助] 胶回收产物连接后片段大小

酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收200-1000bp片段，然后连了个接头，再跑PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检测竟然出现500-1800bp，这是怎么回事啊？
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1楼 2012-06-26 14:01:13
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loveyjc

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ZOEY21: 金币+2, ★有帮助 2012-06-26 16:24:52
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-26 16:46:52
建议你琼脂糖凝胶电泳切胶回收200-500bp片段，然后连了个接头，再跑PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检测看看，这时候差不多可以得到你需要的长度！
   另外，注意割胶时的操作！
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2楼2012-06-26 16:12:16
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by loveyjc at 2012-06-26 16:12:16
建议你琼脂糖凝胶电泳切胶回收200-500bp片段，然后连了个接头，再跑PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检测看看，这时候差不多可以得到你需要的长度！
   另外，注意割胶时的操作！

谢谢！所以是我切胶的问题吗？我切胶时电泳跑的时间不短啊，Marker的2000和1000bp分的很清楚。关键是我想回收的范围在200-1000bp。我跑PCR后出现1800多是不是说明连接出问题了啊？
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3楼2012-06-26 16:27:39
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ZOEY21: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-06-27 08:23:56
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-06-27 13:37:14
小tips: 先跑胶，后染色，能让片段大小被估计更准一些；
注意电流不要过大，温度过高也跑胶结果也有影响
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4楼2012-06-26 21:02:26
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gaoyang636 at 2012-06-26 21:02:26
小tips: 先跑胶，后染色，能让片段大小被估计更准一些；
注意电流不要过大，温度过高也跑胶结果也有影响

谢谢！不知道是什么原因，以为是连接体系有问题。跑电泳是稳压120V，太高了吗？今天调低再试试吧...
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5楼2012-06-27 08:25:54
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loveyjc

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-06-27 13:37:32
不是连接体系的问题，如果是连接问题，PCR就扩不出来了，肯定是跑胶或切胶的问题，可能是没跑开，小片段里混有大片段，所以建议你切的片段短一点，我以前也做过的。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

ZOEY21
6楼2012-06-27 08:47:47
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by loveyjc at 2012-06-27 08:47:47
不是连接体系的问题，如果是连接问题，PCR就扩不出来了，肯定是跑胶或切胶的问题，可能是没跑开，小片段里混有大片段，所以建议你切的片段短一点，我以前也做过的。

上午做了个PCR，降低电压跑了一次，条带好多了，不过我们紫外成像效果不好看不清楚。晚上再重切胶看看。
谢谢啊！敢问高人是做微卫星引物筛选吗？
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7楼2012-06-27 15:52:57
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sk_yb

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ZOEY21: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2012-06-28 08:24:39
加完接头PCR产物会增加，不过不会增加这么大。应该是电泳或marker的问题
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8楼2012-06-27 20:57:42
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sk_yb at 2012-06-27 20:57:42
加完接头PCR产物会增加，不过不会增加这么大。应该是电泳或marker的问题

谢谢啊！原来不知道加完接头PCR什么效果。就是觉得这么大的片段太离谱，感觉有问题，也不知道在卡在哪里。
重新切了胶，改变了电泳条件，看看结果怎么样。
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9楼2012-06-28 08:26:28
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loveyjc

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ZOEY21 at 2012-06-27 15:52:57
上午做了个PCR，降低电压跑了一次，条带好多了，不过我们紫外成像效果不好看不清楚。晚上再重切胶看看。
谢谢啊！敢问高人是做微卫星引物筛选吗？...

是的
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10楼2012-06-28 09:13:59
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