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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胶回收产物连接后片段大小
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ZOEY21

金虫 (小有名气)

[求助] 胶回收产物连接后片段大小

酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收200-1000bp片段，然后连了个接头，再跑PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检测竟然出现500-1800bp，这是怎么回事啊？
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1楼 2012-06-26 14:01:13
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by loveyjc at 2012-06-26 16:12:16
建议你琼脂糖凝胶电泳切胶回收200-500bp片段，然后连了个接头，再跑PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检测看看，这时候差不多可以得到你需要的长度！
   另外，注意割胶时的操作！

谢谢！所以是我切胶的问题吗？我切胶时电泳跑的时间不短啊，Marker的2000和1000bp分的很清楚。关键是我想回收的范围在200-1000bp。我跑PCR后出现1800多是不是说明连接出问题了啊？
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3楼2012-06-26 16:27:39
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gaoyang636 at 2012-06-26 21:02:26
小tips: 先跑胶，后染色，能让片段大小被估计更准一些；
注意电流不要过大，温度过高也跑胶结果也有影响

谢谢！不知道是什么原因，以为是连接体系有问题。跑电泳是稳压120V，太高了吗？今天调低再试试吧...
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5楼2012-06-27 08:25:54
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by loveyjc at 2012-06-27 08:47:47
不是连接体系的问题，如果是连接问题，PCR就扩不出来了，肯定是跑胶或切胶的问题，可能是没跑开，小片段里混有大片段，所以建议你切的片段短一点，我以前也做过的。

上午做了个PCR，降低电压跑了一次，条带好多了，不过我们紫外成像效果不好看不清楚。晚上再重切胶看看。
谢谢啊！敢问高人是做微卫星引物筛选吗？
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7楼2012-06-27 15:52:57
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by sk_yb at 2012-06-27 20:57:42
加完接头PCR产物会增加，不过不会增加这么大。应该是电泳或marker的问题

谢谢啊！原来不知道加完接头PCR什么效果。就是觉得这么大的片段太离谱，感觉有问题，也不知道在卡在哪里。
重新切了胶，改变了电泳条件，看看结果怎么样。
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9楼2012-06-28 08:26:28
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by loveyjc at 2012-06-28 09:13:59
是的...

激动啊！ 膜拜啊！我有很多问题啊先问个低级的。关于那个探针，在重复序列前一定要有几个碱基吗？比如CA repeat：biotin-ATAGAATAT ( CA )15。还是在重复序列前直接用生物素修饰就可以了？比如CA repeat：biotin-( CA )15。我看大多文献就是用生物素标记的某某重复，但RAJENDRA P.1994里的探针是前面有碱基序列的。求赐教orz
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12楼2012-06-28 10:34:16
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
谢谢楼上的各位！不知我在这回复大家看不看得到。
我加大了胶浓度，调低了电压，跑出了想要的片段。再次谢谢各位大神的帮助
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13楼2012-06-29 14:41:27
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by guaitutu at 2012-06-28 09:23:43
你做的与我所做的很是相似，但是我得到的结果却是大片段中混有小片段，常常是切胶回收300-500bp片段，却总是PCR扩出100-200bp片段，这种情况苦恼了我很长时间，请高人指教，谢谢！

不知你的问题解决没 我是跑胶出了问题。加大胶浓度、调低电压就好了。PCR出100-200bp的片段，你确定不是引物二聚体什么的吗
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14楼2012-06-29 14:44:24
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
???????:
16?: Originally posted by guaitutu at 2012-06-29 15:28:59
我曾??使用4%的胶进行4??时电泳，胶回收???的片段??次PCR，结果还是这样。我觉得这个应该??是引物二???体。

? ??
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17楼2012-06-29 16:30:41
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