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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 野生菌产脂肪酶问题
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)

[交流] 野生菌产脂肪酶问题

大家好，我想问一下一般野生菌产脂肪酶量大不？如黑曲霉，其酶活的测定可以用碱滴定法测出来吗？谢谢各位
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1楼 2012-06-11 23:18:41
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post_ngao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 秦川萝卜头 at 2012-06-20 14:39:09
您用pnpp法测得的结果稳定吗？能告诉我您pnpp的操作方法吗？我测的结果不是很稳定啊?非常着急...

2.1.3.7 脂肪酶活力测定
(1) 酸碱滴定法[3]
5mL 反应体系包括4.4mL 50mM pH8.0磷酸盐缓冲液，500μL 乳化底物和100μL 待测酶液。根据待测酶液活力的大小可以适当增减待测酶液的体积，增减的体积利用增减缓冲液相同的体积来调整。利用蒸馏水代替待测酶液测定空白对照。反应体系置于恒温摇床中，设定某一测活温度，摇床转数为150-180rpm，反应5min. 根据待测酶液活力的大小可以适当调整反应时间。反应结束后迅速向反应体系中倒入1:1（v/v）的乙醇/丙酮混合液终止反应，以酚酞为指示剂，用新鲜的20mM NaOH溶液精确进行滴定，记录下每次所用的NaOH的体积并计算酶活力，公式如下：
(1)
VNaOH酶：含酶反应体系中滴定消耗的NaOH 的体积（mL）；VNaOH空白：空白对照中滴定消耗的NaOH 的体积（mL）；CNaOH：NaOH 的浓度（mM）；t：反应时间（min）；V酶：待测酶液的体积（mL）；C酶：待测酶液酶的浓度（mg/mL）。能够在1 分钟内水解底物生成1μmol 脂肪酸的酶量即定义为1 个酶活力单位（U）。
底物乳化液的配制：首先配制4%（w/v）的聚乙烯醇溶液，而后取1mL甘油三酯或橄榄油底物与4mL上述聚乙烯醇溶液充分混合，冰浴条件下超声直至溶液变成均一的乳白色溶液。乳化液于4℃保存，使用前需要重新超声乳化。
(2) 光吸收法
测活体系包括930μL 50mM pH8.0的磷酸缓冲液，20μL 10mM pNP-C8底物溶液，50μL 待测酶液。根据待测酶液活力的大小可以适当增减待测酶液的体积，增减的体积利用增减缓冲液相同的体积来调整。利用蒸馏水代替待测酶液测定空白对照。在待测温度下用UV2550 紫外可见分光光度计测定测活体系于405nm 处的吸收值。能够在1 分钟内水解底物生成1μmol 对硝基苯酚的酶量即定义为1 个酶活力单位（U）。
酶活计算公式如下：
(2)
其中△OD405：相同时间内于405nm 处，含待测酶液的测活体系的吸收变化值与空白对照组的差值； V：测活体积（本方法中为1mL）；ε为摩尔消光系数，ε =0.016μM-1；t：测活时间（min）；V酶：测活体系中加入的待测酶液的体积（mL，本方法中为0.05mL）；C酶：待测酶液的蛋白浓度(mg/mL).

公式一



公式二
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12楼2012-06-20 20:53:00
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lxdjxr

木虫 (小有名气)
★
秦川萝卜头(金币+1): 谢谢参与
曲霉不是产脂肪酶较好的天然菌；可以考虑根霉！
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2楼2012-06-13 10:49:31
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxdjxr at 2012-06-13 10:49:31
曲霉不是产脂肪酶较好的天然菌；可以考虑根霉！

您用橄榄油乳化法测过脂肪酶活性没啊
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3楼2012-06-13 13:52:26
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xujb32

银虫 (知名作家)
★
秦川萝卜头(金币+1): 谢谢参与
好像是米根霉的，酶活貌似不大
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4楼2012-06-13 16:58:09
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post_ngao

木虫 (正式写手)
★
秦川萝卜头(金币+1): 谢谢参与
一般的野生菌产脂肪酶的活力都不高，因为在生存环境中一般也不需要分解很多的脂肪，所以为了得到大量脂肪酶一般都是重组表达的。滴定（如橄榄油等油脂类底物）或者pNP底物都可以测脂肪酶的活力，相对而言后者更简便，但是活力不精确，一般用于初步测定。如果LZ一定要测野生菌的脂肪酶活力，推荐大体积发酵，否则小体积培养一般很难测得准。
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5楼2012-06-14 11:01:22
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by post_ngao at 2012-06-14 11:01:22
一般的野生菌产脂肪酶的活力都不高，因为在生存环境中一般也不需要分解很多的脂肪，所以为了得到大量脂肪酶一般都是重组表达的。滴定（如橄榄油等油脂类底物）或者pNP底物都可以测脂肪酶的活力，相对而言后者更简便 ...

大体积发酵跟小体积发酵有什么差别啊？您用过pnpp法吗？
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6楼2012-06-18 16:10:13
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post_ngao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 秦川萝卜头 at 2012-06-18 16:10:13
大体积发酵跟小体积发酵有什么差别啊？您用过pnpp法吗？...

大体积的时候叫发酵，小体积只可以称作培养了。差别有很多啊，首先就是容器不一样，发酵一般用罐，培养就是摇瓶啦；发酵可以用玉米浆啊之类的粗培养基，培养一般就是酵母浸出物、胰蛋白胨啊之类的；发酵靠泵通气，培养就是靠摇床摇啦；发酵可以随时滤出发酵液，补充新液，培养就只能摇到时候离心取上清。。。有很多的。不过一般情况下，包括养野生菌，发酵得到的酶会比较多，培养会相对而言少一些，但是发酵自然也很麻烦的，一般需要一宿一宿的睡在罐子旁边看着。
     pnpp很简单啊，就是把缓冲液+底物+酶液混在一起测紫外就ok啦，非常没有技术含量，不过代价就是这种底物非常的贵。。。
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7楼2012-06-19 09:05:17
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necilyx

金虫 (正式写手)
★
秦川萝卜头(金币+1): 谢谢参与
测野生菌的脂肪酶意义不大，量太少，建议可以先从野生菌中获得相对产酶量大的再进行一下菌株选育~
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8楼2012-06-19 16:20:28
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by post_ngao at 2012-06-19 09:05:17
大体积的时候叫发酵，小体积只可以称作培养了。差别有很多啊，首先就是容器不一样，发酵一般用罐，培养就是摇瓶啦；发酵可以用玉米浆啊之类的粗培养基，培养一般就是酵母浸出物、胰蛋白胨啊之类的；发酵靠泵通气， ...

您用pnpp法测得的结果稳定吗？能告诉我您pnpp的操作方法吗？我测的结果不是很稳定啊?非常着急
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9楼2012-06-20 14:39:09
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by necilyx at 2012-06-19 16:20:28
测野生菌的脂肪酶意义不大，量太少，建议可以先从野生菌中获得相对产酶量大的再进行一下菌株选育~

“建议可以先从野生菌中获得相对产酶量大的再进行一下菌株选育~”
再进行一下菌株选育是什么意思？
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10楼2012-06-20 14:58:50
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necilyx

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 秦川萝卜头 at 2012-06-20 14:58:50
“建议可以先从野生菌中获得相对产酶量大的再进行一下菌株选育~”
再进行一下菌株选育是什么意思？...

理化诱变或者基因改造~~如果楼主是搞实践的可以用用理化诱变筛选高产菌株，方法简单实验条件易获得，也有一定的高产菌株获得的比率，然后高小瓶，大罐发酵可以得到较多的脂肪酶~要是想搞理论科研的做做分子基因方面，构建个高产脂肪酶工程菌什么的~~
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11楼2012-06-20 17:30:39
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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by post_ngao at 2012-06-20 20:53:00
2.1.3.7 脂肪酶活力测定
(1) 酸碱滴定法
5mL 反应体系包括4.4mL 50mM pH8.0磷酸盐缓冲液，500μL 乳化底物和100μL 待测酶液。根据待测酶液活力的大小可以适当增减待测酶液的体积，增减的体积利用增减缓冲液相同 ...

PNPp法测脂肪酶活性，其结果受pH影响很大，如果测不同发酵液的酶活，每一批测的时候是否要调一下pH呢？
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13楼2012-06-24 09:10:26
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neu234

木虫之王 (文学泰斗)
★
秦川萝卜头(金币+1): 谢谢参与
量不大
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14楼2012-06-24 12:16:55
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