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秦川萝卜头

金虫 (小有名气)

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[交流] 野生菌产脂肪酶问题

大家好，我想问一下一般野生菌产脂肪酶量大不？如黑曲霉，其酶活的测定可以用碱滴定法测出来吗？谢谢各位

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1楼 2012-06-11 23:18:41

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post_ngao

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

9楼: Originally posted by 秦川萝卜头 at 2012-06-20 14:39:09
您用pnpp法测得的结果稳定吗？能告诉我您pnpp的操作方法吗？我测的结果不是很稳定啊?非常着急...

2.1.3.7 脂肪酶活力测定
(1) 酸碱滴定法[3]
5mL 反应体系包括4.4mL 50mM pH8.0磷酸盐缓冲液，500μL 乳化底物和100μL 待测酶液。根据待测酶液活力的大小可以适当增减待测酶液的体积，增减的体积利用增减缓冲液相同的体积来调整。利用蒸馏水代替待测酶液测定空白对照。反应体系置于恒温摇床中，设定某一测活温度，摇床转数为150-180rpm，反应5min. 根据待测酶液活力的大小可以适当调整反应时间。反应结束后迅速向反应体系中倒入1:1（v/v）的乙醇/丙酮混合液终止反应，以酚酞为指示剂，用新鲜的20mM NaOH溶液精确进行滴定，记录下每次所用的NaOH的体积并计算酶活力，公式如下：
(1)
VNaOH酶：含酶反应体系中滴定消耗的NaOH 的体积（mL）；VNaOH空白：空白对照中滴定消耗的NaOH 的体积（mL）；CNaOH：NaOH 的浓度（mM）；t：反应时间（min）；V酶：待测酶液的体积（mL）；C酶：待测酶液酶的浓度（mg/mL）。能够在1 分钟内水解底物生成1μmol 脂肪酸的酶量即定义为1 个酶活力单位（U）。
底物乳化液的配制：首先配制4%（w/v）的聚乙烯醇溶液，而后取1mL甘油三酯或橄榄油底物与4mL上述聚乙烯醇溶液充分混合，冰浴条件下超声直至溶液变成均一的乳白色溶液。乳化液于4℃保存，使用前需要重新超声乳化。
(2) 光吸收法
测活体系包括930μL 50mM pH8.0的磷酸缓冲液，20μL 10mM pNP-C8底物溶液，50μL 待测酶液。根据待测酶液活力的大小可以适当增减待测酶液的体积，增减的体积利用增减缓冲液相同的体积来调整。利用蒸馏水代替待测酶液测定空白对照。在待测温度下用UV2550 紫外可见分光光度计测定测活体系于405nm 处的吸收值。能够在1 分钟内水解底物生成1μmol 对硝基苯酚的酶量即定义为1 个酶活力单位（U）。
酶活计算公式如下：
(2)
其中△OD405：相同时间内于405nm 处，含待测酶液的测活体系的吸收变化值与空白对照组的差值； V：测活体积（本方法中为1mL）；ε为摩尔消光系数，ε =0.016μM-1；t：测活时间（min）；V酶：测活体系中加入的待测酶液的体积（mL，本方法中为0.05mL）；C酶：待测酶液的蛋白浓度(mg/mL).

公式一

公式二