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hepeng1224

银虫 (小有名气)

[求助] 求助质粒提取

目的片段连T载体后转入大肠杆菌，筛选阳性克隆摇菌提质粒后电泳检测没有条带，重做也是如此。但是用提取的质粒扩目的基因却能扩增出来，为什么？应该怎么办？
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1楼 2012-05-17 19:12:05
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用什么提的质粒？是试剂盒还是手提的？
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未来不是梦
2楼2012-05-17 19:48:32
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-17 20:25:01
hepeng1224: 金币+5, ★有帮助 2012-05-19 09:55:21
你这个质粒在大肠杆菌的拷贝数多大？如果是拷贝数低的话，可以浓缩后电泳。不过也不排除PCR假阳性的可能。
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
3楼2012-05-17 19:48:45
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
hepeng1224: 回帖置顶 2012-05-19 09:57:17
T载体的拷贝数是很高的，而且，就算是假阳性，应该也有质粒可以抽出来。

你要测试一下你提取质粒的浓度，然后，选择对照去跑胶。

没有问题大家都很h，但是出现问题就要一个一个的排除。
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致良知
4楼2012-05-17 23:18:52
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hepeng1224

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-17 19:48:32:
你用什么提的质粒？是试剂盒还是手提的？

用的是生工的试剂盒呀，
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5楼2012-05-18 14:35:54
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xmuring

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意三楼的说法，提完质粒之后最好先去测一下浓度，不然你怎么确定电泳的上样量呢？电泳检测好像浓度在20 ng/微升以下的是看不到条带的，但是PCR只要有一点点模板就可以扩增出来
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2012-05-18 20:00:00
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们做的时候一般是在挑菌摇菌前，先做下菌落pcr，同时影印（就是用枪头点下）相应的菌在新的平板上，然后根据菌落pcr结果再挑影印平板上的菌摇菌提质粒，肯定能提出质粒且扩出基因。做菌落pcr的目的就是为了确认你的目的基因钻进去了！
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2012-05-18 23:15:59
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hepeng1224

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-05-18 23:15:59:
我们做的时候一般是在挑菌摇菌前，先做下菌落pcr，同时影印（就是用枪头点下）相应的菌在新的平板上，然后根据菌落pcr结果再挑影印平板上的菌摇菌提质粒，肯定能提出质粒且扩出基因。做菌落pcr的目的就是为了确认 ...

谢谢
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8楼2012-05-19 09:56:56
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hepeng1224

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xmuring at 2012-05-18 20:00:00:
同意三楼的说法，提完质粒之后最好先去测一下浓度，不然你怎么确定电泳的上样量呢？电泳检测好像浓度在20 ng/微升以下的是看不到条带的，但是PCR只要有一点点模板就可以扩增出来

多谢
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9楼2012-05-19 09:57:05
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