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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 碱裂解法提取质粒中为什么要冰浴？
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jianlanyou

银虫 (正式写手)

[求助] 碱裂解法提取质粒中为什么要冰浴？已有3人参与

如题，碱法提取质粒中溶液一和溶液三为什么要冰浴？
求回答全面细致精准。
我知道现在有专门做这个的试剂盒，但我是要参加研究生复试，不知道面试时会不会提问，所以冰浴的原理必须搞清楚。
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1楼2014-03-11 20:03:48
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一样一样1990

新虫 (初入文坛)
溶液III 的作用 溶液III 加入后就会有大量的沉淀，与SDS 的加入有关系。十二烷基硫酸钠 （sodium dodecylsulfate）SDS 遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。溶液III 加入后的 沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的 盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸 上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白 质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程 不难想象，因为基因组DNA 太长了，长长的DNA 自然容易被PDS 给共沉淀了， 尽管SDS 并不与DNA 分子结合。 2 M 的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要 中和之。基因组DNA 一旦发生断裂，只要是50－100 kb 大小的片断，就没有办 5 法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后 得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓 的总DNA 条带。很多人误认为是溶液III 加入后基因组DNA 无法快速复性就被 沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA 分子在中性溶液 中都是溶解的。NaOH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副 产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III 加入并混合均匀后在冰上放 置，目的是为了PDS 沉淀更充分一点。
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2楼2014-03-12 21:31:56
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一样一样1990

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dllchina: 金币+5, 鼓励应助，新虫+5金币 2014-03-12 23:11:36
溶液III 的作用 溶液III 加入后就会有大量的沉淀，与SDS 的加入有关系。十二烷基硫酸钠 （sodium dodecylsulfate）SDS 遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。溶液III 加入后的 沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的 盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸 上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白 质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程 不难想象，因为基因组DNA 太长了，长长的DNA 自然容易被PDS 给共沉淀了， 尽管SDS 并不与DNA 分子结合。 2 M 的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要 中和之。基因组DNA 一旦发生断裂，只要是50－100 kb 大小的片断，就没有办 5 法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后 得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓 的总DNA 条带。很多人误认为是溶液III 加入后基因组DNA 无法快速复性就被 沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA 分子在中性溶液 中都是溶解的。NaOH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副 产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III 加入并混合均匀后在冰上放 置，目的是为了PDS 沉淀更充分一点。
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3楼2014-03-12 21:34:37
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jianlanyou

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 一样一样1990 at 2014-03-12 21:34:37
溶液III 的作用 溶液III 加入后就会有大量的沉淀，与SDS 的加入有关系。十二烷基硫酸钠 （sodium dodecylsulfate）SDS 遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此 ...

这不就是生物在线那个著名的帖子的原文吗？我看过
只是觉得，冰浴难道只是为了让PDS（十二烷基硫酸钾）沉淀充分？貌似有些牵强。
DNA变性和复性有一个“淬火”的概念，即变性后骤冷，DNA难以复性。我在想冰浴是不是想起到“淬火”的作用？
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4楼2014-03-13 10:00:11
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yinzheng

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
jianlanyou: 金币+1, ★有帮助, 已经做了好几次提质粒的实验了，谢谢你的答案 2014-05-13 22:26:58
在冰水中，只有质粒能够复性，其他DNA不能复兴，然后离心分离，相当于提纯质粒
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5楼2014-05-11 22:47:51
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
jianlanyou: 金币+1, ★有帮助, RNA我们是在加入溶液一的时候加入一定量的RNase 2014-05-13 22:27:41
低温下生成的PDS更容易沉淀下来，这个时候也是除RNA的时候

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-05-11 23:07:19
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