24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 1099  |  回复: 8

hepeng1224

银虫 (小有名气)

[求助] 求助质粒提取

目的片段连T载体后转入大肠杆菌,筛选阳性克隆摇菌提质粒后电泳检测没有条带,重做也是如此。但是用提取的质粒扩目的基因却能扩增出来,为什么?应该怎么办?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你用什么提的质粒?是试剂盒还是手提的?
未来不是梦
2楼2012-05-17 19:48:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-17 20:25:01
hepeng1224: 金币+5, 有帮助 2012-05-19 09:55:21
你这个质粒在大肠杆菌的拷贝数多大?如果是拷贝数低的话,可以浓缩后电泳。不过也不排除PCR假阳性的可能。
修炼ing,当虫仙……
3楼2012-05-17 19:48:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
hepeng1224: 回帖置顶 2012-05-19 09:57:17
T载体的拷贝数是很高的,而且,就算是假阳性,应该也有质粒可以抽出来。

你要测试一下你提取质粒的浓度,然后,选择对照去跑胶。

没有问题大家都很h,但是出现问题就要一个一个的排除。
致良知
4楼2012-05-17 23:18:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hepeng1224

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-17 19:48:32:
你用什么提的质粒?是试剂盒还是手提的?

用的是生工的试剂盒呀,
5楼2012-05-18 14:35:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xmuring

木虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
同意三楼的说法,提完质粒之后最好先去测一下浓度,不然你怎么确定电泳的上样量呢?电泳检测好像浓度在20 ng/微升以下的是看不到条带的,但是PCR只要有一点点模板就可以扩增出来
6楼2012-05-18 20:00:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牧歌ping

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们做的时候一般是在挑菌摇菌前,先做下菌落pcr,同时影印(就是用枪头点下)相应的菌在新的平板上,然后根据菌落pcr结果再挑影印平板上的菌摇菌提质粒,肯定能提出质粒且扩出基因。做菌落pcr的目的就是为了确认你的目的基因钻进去了!
7楼2012-05-18 23:15:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hepeng1224

银虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-05-18 23:15:59:
我们做的时候一般是在挑菌摇菌前,先做下菌落pcr,同时影印(就是用枪头点下)相应的菌在新的平板上,然后根据菌落pcr结果再挑影印平板上的菌摇菌提质粒,肯定能提出质粒且扩出基因。做菌落pcr的目的就是为了确认 ...

谢谢
8楼2012-05-19 09:56:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hepeng1224

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by xmuring at 2012-05-18 20:00:00:
同意三楼的说法,提完质粒之后最好先去测一下浓度,不然你怎么确定电泳的上样量呢?电泳检测好像浓度在20 ng/微升以下的是看不到条带的,但是PCR只要有一点点模板就可以扩增出来

多谢
9楼2012-05-19 09:57:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hepeng1224 的主题更新
信息提示
请填处理意见