应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR问题求教
131/2返回列表12下一页
查看: 1973  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

elbo

金虫 (小有名气)

[求助] PCR问题求教

扩增细菌16S rDNA,通用引物，反应体系25ul, 用TAKARA的premix，1ul模板（含量大于40ng/ul，每孔所用模板DNA不同），1.5ul引物（10umol/L）。扩增条件，94预变性3min，94,52,72各1min，25循环，72延伸10min。1%凝胶检测如下图，最左侧为不加模板的阴性对照.最右边为Marker（第4个带为1500bp）.为什么只有个别扩增出来，而且怎么有这么多的引物二聚体？退后温度低？还是模板含量太少？？
请各位达人不吝赐教啊！！

1% agarose
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-05-02 19:16:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by elbo at 2012-05-03 05:52:17:
那么出现 引物二聚体的原因？引物是新配置的。

已经说了啊，引物二聚体的原因是引物以自身为模板将自己扩增出来了。之所以这样是因为你的引物3·端出现了错配，互补。楼主可以验证一下，实验顺利
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2012-05-03 09:18:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核, 辛苦辛苦 2012-05-03 13:40:31
从图上看你所有样品都有二聚体。可能原因之一就是引物二聚体，就是引物以自己为模板把自己扩增出来了。原因之二可能是体系被污染，原因之三可能是退火温度太低。我认为前两个原因的可能性较大，建议做个NTC，同时换个无酶水
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-02 20:20:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)
不好意思，刚看了一下，你已经做了NTC，所以最可能的原因是引物自身，引物以自己为模板把自己扩增出来了
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-02 20:21:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elbo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-02 20:20:26:
从图上看你所有样品都有二聚体。可能原因之一就是引物二聚体，就是引物以自己为模板把自己扩增出来了。原因之二可能是体系被污染，原因之三可能是退火温度太低。我认为前两个原因的可能性较大，建议做个NTC，同时 ...

那么出现 引物二聚体的原因？引物是新配置的。
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-03 05:52:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elbo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-03 09:18:25:
已经说了啊，引物二聚体的原因是引物以自身为模板将自己扩增出来了。之所以这样是因为你的引物3·端出现了错配，互补。楼主可以验证一下，实验顺利

引物设计不合理吗？
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-03 18:17:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 18:43:17
试着帮你分析：可能是引物相对于模板多了，你把引物加1微升试试。既然是通用引物，没必要怀疑设计不合理。还有就是你的模板，你说40ng/ul ，电泳检测的么？如果不是，电泳检测一下。
赞一下 回复此楼
7楼2012-05-03 21:54:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做个退火温度的梯度实验吧，52度退火有点低。不是相同模板，有的没扩增只能说明模板不好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-03 23:42:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

piaoyunokok

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 18:43:37
我觉得退火温度没有必要优化了，毕竟不是非特异扩增比较多。看图可能你的模板不同结果还不同，也有可能提取过程中有的效果不是很好吧。。。
赞一下 回复此楼
9楼2012-05-04 00:04:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

D调的小E

铁杆木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-04 18:43:45
首先建议你先检测一下模板。如果模板浓度没有问题，有可能是你引物的结合能力不是很好。还有不确定你的引物设计时是否验证过自身的配对等等。另外个人觉得你的循环数可以适当增加，同时适当减少每一步循环的时间。有些时候PCR的外界影响因素也很大。。。希望能帮的上你~~~另祝实验顺利~~~
赞一下 回复此楼
You just need a little faith!
10楼2012-05-04 00:55:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 elbo 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 327求调剂 +26 Xxjc1107. 2026-04-13 29/1450 2026-04-16 10:52 by Espannnnnol
[考研] 恳请有学校收留 +6 柯淮然 2026-04-12 6/300 2026-04-16 07:23 by 学员JpLReM
[考研] 310求调剂 +16 666真好 2026-04-11 18/900 2026-04-15 13:28 by 黑科技矿业
[考研] 药学305求调剂 +7 玛卡巴卡boom 2026-04-11 7/350 2026-04-15 13:21 by 西北望—风沙
[考研] 272分材料子求调剂 +41 Loy0361 2026-04-10 54/2700 2026-04-14 18:00 by lhj2009
[考研] 化工学硕294分，求导师收留 +32 yzyzx 2026-04-12 36/1800 2026-04-14 17:45 by lhj2009
[考研] 机械还有还有名额吗？太难了 +8 笑笑袁 2026-04-10 8/400 2026-04-14 08:44 by screening
[考研] 332求调剂 +15 蕉蕉123 2026-04-10 15/750 2026-04-13 23:12 by pies112
[考研] 293求调剂 +16 我爱高数高数爱� 2026-04-12 18/900 2026-04-13 21:47 by 学员JpLReM
[考研] 344 材料专业 求调剂211 无地域要求 +8 hualkop 2026-04-11 8/400 2026-04-12 22:24 by fqwang
[考研] 电气工程专硕320求调剂 +5 小麻子111 2026-04-10 5/250 2026-04-12 10:47 by zhouyuwinner
[考研] 291求调剂 +8 关忆北. 2026-04-11 8/400 2026-04-12 09:32 by 逆水乘风
[考研] 求调剂，一志愿材料科学与工程985，365分， +8 材化李可 2026-04-11 10/500 2026-04-12 08:42 by 852137818
[考研] 284求调剂 +11 archer.. 2026-04-09 12/600 2026-04-11 20:23 by 蓝云思雨
[考研] 085600材料与化工329分求调剂 +16 叶zilin 2026-04-10 16/800 2026-04-11 11:04 by may_新宇
[考研] 本科211 工科085400 280分求调剂 可跨专业 +11 LZH（等待调剂中 2026-04-10 11/550 2026-04-11 08:39 by zhq0425
[考研] 342电子信息专硕求调剂 +9 你让我怎么荔枝 2026-04-10 10/500 2026-04-11 08:33 by zhq0425
[考研] 化学工程与技术324调剂 +23 孙常华 2026-04-09 25/1250 2026-04-11 00:07 by 骑牛渡寒江
[考研] 一志愿北理工298英一数二已上岸，感谢各位老师 +14 Reframe 2026-04-10 16/800 2026-04-10 23:07 by caotw2020
[考研] 282，电气工程专业，求调剂，不挑专业 +9 jggshjkkm 2026-04-10 9/450 2026-04-10 14:55 by 逆水乘风
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭