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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR问题求教
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elbo

金虫 (小有名气)

[求助] PCR问题求教

扩增细菌16S rDNA,通用引物，反应体系25ul, 用TAKARA的premix，1ul模板（含量大于40ng/ul，每孔所用模板DNA不同），1.5ul引物（10umol/L）。扩增条件，94预变性3min，94,52,72各1min，25循环，72延伸10min。1%凝胶检测如下图，最左侧为不加模板的阴性对照.最右边为Marker（第4个带为1500bp）.为什么只有个别扩增出来，而且怎么有这么多的引物二聚体？退后温度低？还是模板含量太少？？
请各位达人不吝赐教啊！！

1% agarose
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1楼 2012-05-02 19:16:39
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做个退火温度的梯度实验吧，52度退火有点低。不是相同模板，有的没扩增只能说明模板不好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2012-05-03 23:42:59
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核, 辛苦辛苦 2012-05-03 13:40:31
从图上看你所有样品都有二聚体。可能原因之一就是引物二聚体，就是引物以自己为模板把自己扩增出来了。原因之二可能是体系被污染，原因之三可能是退火温度太低。我认为前两个原因的可能性较大，建议做个NTC，同时换个无酶水
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2楼2012-05-02 20:20:26
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孙启亮

金虫 (著名写手)
不好意思，刚看了一下，你已经做了NTC，所以最可能的原因是引物自身，引物以自己为模板把自己扩增出来了
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3楼2012-05-02 20:21:57
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elbo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-02 20:20:26:
从图上看你所有样品都有二聚体。可能原因之一就是引物二聚体，就是引物以自己为模板把自己扩增出来了。原因之二可能是体系被污染，原因之三可能是退火温度太低。我认为前两个原因的可能性较大，建议做个NTC，同时 ...

那么出现 引物二聚体的原因？引物是新配置的。
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4楼2012-05-03 05:52:17
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