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elbo

金虫 (小有名气)

[求助] PCR问题求教

扩增细菌16S rDNA,通用引物,反应体系25ul, 用TAKARA的premix,1ul模板(含量大于40ng/ul,每孔所用模板DNA不同),1.5ul引物(10umol/L)。扩增条件,94预变性3min,94,52,72各1min,25循环,72延伸10min。1%凝胶检测如下图,最左侧为不加模板的阴性对照.最右边为Marker(第4个带为1500bp).为什么只有个别扩增出来,而且怎么有这么多的引物二聚体?退后温度低?还是模板含量太少??
请各位达人不吝赐教啊!!

1% agarose
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by elbo at 2012-05-03 05:52:17:
那么出现 引物二聚体的原因?引物是新配置的。

已经说了啊,引物二聚体的原因是引物以自身为模板将自己扩增出来了。之所以这样是因为你的引物3·端出现了错配,互补。楼主可以验证一下,实验顺利
5楼2012-05-03 09:18:25
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普通回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 专家考核, 辛苦辛苦 2012-05-03 13:40:31
从图上看你所有样品都有二聚体。可能原因之一就是引物二聚体,就是引物以自己为模板把自己扩增出来了。原因之二可能是体系被污染,原因之三可能是退火温度太低。我认为前两个原因的可能性较大,建议做个NTC,同时换个无酶水
2楼2012-05-02 20:20:26
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孙启亮

金虫 (著名写手)

不好意思,刚看了一下,你已经做了NTC,所以最可能的原因是引物自身,引物以自己为模板把自己扩增出来了
3楼2012-05-02 20:21:57
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elbo

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-02 20:20:26:
从图上看你所有样品都有二聚体。可能原因之一就是引物二聚体,就是引物以自己为模板把自己扩增出来了。原因之二可能是体系被污染,原因之三可能是退火温度太低。我认为前两个原因的可能性较大,建议做个NTC,同时 ...

那么出现 引物二聚体的原因?引物是新配置的。
4楼2012-05-03 05:52:17
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elbo

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-03 09:18:25:
已经说了啊,引物二聚体的原因是引物以自身为模板将自己扩增出来了。之所以这样是因为你的引物3·端出现了错配,互补。楼主可以验证一下,实验顺利

引物设计不合理吗?
6楼2012-05-03 18:17:05
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)


西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 18:43:17
试着帮你分析:可能是引物相对于模板多了,你把引物加1微升试试。既然是通用引物,没必要怀疑设计不合理。还有就是你的模板,你说40ng/ul ,电泳检测的么?如果不是,电泳检测一下。
7楼2012-05-03 21:54:53
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
做个退火温度的梯度实验吧,52度退火有点低。不是相同模板,有的没扩增只能说明模板不好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
8楼2012-05-03 23:42:59
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 18:43:37
我觉得退火温度没有必要优化了,毕竟不是非特异扩增比较多。看图可能你的模板不同结果还不同,也有可能提取过程中有的效果不是很好吧。。。
9楼2012-05-04 00:04:27
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D调的小E

铁杆木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, Good! 2012-05-04 18:43:45
首先建议你先检测一下模板。如果模板浓度没有问题,有可能是你引物的结合能力不是很好。还有不确定你的引物设计时是否验证过自身的配对等等。另外个人觉得你的循环数可以适当增加,同时适当减少每一步循环的时间。有些时候PCR的外界影响因素也很大。。。希望能帮的上你~~~另祝实验顺利~~~
You just need a little faith!
10楼2012-05-04 00:55:44
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