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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR问题求教
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elbo

金虫 (小有名气)

[求助] PCR问题求教

扩增细菌16S rDNA,通用引物，反应体系25ul, 用TAKARA的premix，1ul模板（含量大于40ng/ul，每孔所用模板DNA不同），1.5ul引物（10umol/L）。扩增条件，94预变性3min，94,52,72各1min，25循环，72延伸10min。1%凝胶检测如下图，最左侧为不加模板的阴性对照.最右边为Marker（第4个带为1500bp）.为什么只有个别扩增出来，而且怎么有这么多的引物二聚体？退后温度低？还是模板含量太少？？
请各位达人不吝赐教啊！！

1% agarose
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1楼 2012-05-02 19:16:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by elbo at 2012-05-03 05:52:17:
那么出现 引物二聚体的原因？引物是新配置的。

已经说了啊，引物二聚体的原因是引物以自身为模板将自己扩增出来了。之所以这样是因为你的引物3·端出现了错配，互补。楼主可以验证一下，实验顺利
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5楼2012-05-03 09:18:25
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普通回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核, 辛苦辛苦 2012-05-03 13:40:31
从图上看你所有样品都有二聚体。可能原因之一就是引物二聚体，就是引物以自己为模板把自己扩增出来了。原因之二可能是体系被污染，原因之三可能是退火温度太低。我认为前两个原因的可能性较大，建议做个NTC，同时换个无酶水
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2楼2012-05-02 20:20:26
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孙启亮

金虫 (著名写手)
不好意思，刚看了一下，你已经做了NTC，所以最可能的原因是引物自身，引物以自己为模板把自己扩增出来了
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3楼2012-05-02 20:21:57
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elbo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-02 20:20:26:
从图上看你所有样品都有二聚体。可能原因之一就是引物二聚体，就是引物以自己为模板把自己扩增出来了。原因之二可能是体系被污染，原因之三可能是退火温度太低。我认为前两个原因的可能性较大，建议做个NTC，同时 ...

那么出现 引物二聚体的原因？引物是新配置的。
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4楼2012-05-03 05:52:17
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elbo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-03 09:18:25:
已经说了啊，引物二聚体的原因是引物以自身为模板将自己扩增出来了。之所以这样是因为你的引物3·端出现了错配，互补。楼主可以验证一下，实验顺利

引物设计不合理吗？
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6楼2012-05-03 18:17:05
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 18:43:17
试着帮你分析：可能是引物相对于模板多了，你把引物加1微升试试。既然是通用引物，没必要怀疑设计不合理。还有就是你的模板，你说40ng/ul ，电泳检测的么？如果不是，电泳检测一下。
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7楼2012-05-03 21:54:53
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做个退火温度的梯度实验吧，52度退火有点低。不是相同模板，有的没扩增只能说明模板不好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2012-05-03 23:42:59
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 18:43:37
我觉得退火温度没有必要优化了，毕竟不是非特异扩增比较多。看图可能你的模板不同结果还不同，也有可能提取过程中有的效果不是很好吧。。。
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9楼2012-05-04 00:04:27
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D调的小E

铁杆木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-04 18:43:45
首先建议你先检测一下模板。如果模板浓度没有问题，有可能是你引物的结合能力不是很好。还有不确定你的引物设计时是否验证过自身的配对等等。另外个人觉得你的循环数可以适当增加，同时适当减少每一步循环的时间。有些时候PCR的外界影响因素也很大。。。希望能帮的上你~~~另祝实验顺利~~~
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You just need a little faith!
10楼2012-05-04 00:55:44
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