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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关定量PCR，急急急
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lanhuaorchid

金虫 (著名写手)

orchid

[求助] 有关定量PCR，急急急

最近做了好久的定量ＰＣＲ，耗费了不少试剂，但没什么结果，求助……
我是在文献里面找的引物，在普通ＰＣＲ仪上扩的很好，也摸了退火温度的，特异性也挺好的，扩增片段１００－３００之间，但在ＱＰＣＲ仪（伯乐的ＣＦＸ９６）扩增曲线很不好，要么就是只有最高的几个浓度有信号，要么就是Ｃｔ值基本都大于３０，改变退火温度也没有好转，也尝试了改为３步法，没有好转，但从头至尾熔解曲线都较好，想问问群里的大侠，有没有做这方面精通的，望能指点一二，实验各种悲剧呀，急急急
还有同学的定量ＰＣＲ会出现这样的曲线（不好选择ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ），求解释

定量ＰＣＲ扩增曲线
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orchid
1楼 2012-03-27 16:04:29
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回帖置顶 ( 共有1个 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-03-28 10:16:18
引用回帖:
5楼: Originally posted by lanhuaorchid at 2012-03-27 19:15:29:
另外，请问，边缘效应是指？

嗯...........
1. 阙值还是不要手动调整了好，一般机子自行设定的都是比较可靠的，你若没有一定的定量知识就不要手动调整。你也可选择输出实验结果的荧光值，按照LinRegPCR软件计算后进行Ct矫正输出，不过这里只是针对相对定量的应用。
2. 边缘效应是指机子的温度控制越到靠边的行或排就越控制不准，偶用CFX96（学校的新机），每次最右边一列就毛都扩不出来，内参也一样，其他都能正常扩增。
3. 按你说的有调出5cycle有信号的这种，基本是不可能出现的，因为一般的Ct在20到35左右才是正常情况。
4. 你自己实验中说的按照文献的引物来做，但还包括反转录、试剂等等各方面的差异因素，不能说就一定重复出来，这个范围太广，不好提出建议
希望有所帮助
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Let God do with it as He wills
6楼2012-03-27 20:18:53
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普通回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-03-28 10:14:23
嗯.............
Bio-Rad 的CFX本人非常讨厌，有很较强的边缘效应（我本人也对伯乐的东西有偏见、抱歉）
请问你这个做的是标曲吗？有详细内容了我们才方便参谋参谋
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lanhuaorchid
Let God do with it as He wills
2楼2012-03-27 16:19:08
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yhyang916

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币-100, 广告！ 2012-03-27 19:16:51
西瓜: 编辑内容 2012-04-02 11:14
本帖内容被屏蔽
3楼2012-03-27 16:31:15
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lanhuaorchid

金虫 (著名写手)

orchid
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-27 16:19:08:
嗯.............
Bio-Rad 的CFX本人非常讨厌，有很较强的边缘效应（我本人也对伯乐的东西有偏见、抱歉）
请问你这个做的是标曲吗？有详细内容了我们才方便参谋参谋

是标曲，阈值线靠下的话，Ct值均在5以内数据就不好分析了，不正常，阈值线手动向上提的话，测得的样品的数据就不好分析了，对于伯乐的CFX96，木有选择呀
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orchid
4楼2012-03-27 19:10:53
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lanhuaorchid

金虫 (著名写手)

orchid
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-27 16:19:08:
嗯.............
Bio-Rad 的CFX本人非常讨厌，有很较强的边缘效应（我本人也对伯乐的东西有偏见、抱歉）
请问你这个做的是标曲吗？有详细内容了我们才方便参谋参谋

另外，请问，边缘效应是指？
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orchid
5楼2012-03-27 19:15:29
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lanhuaorchid

金虫 (著名写手)

orchid
引用回帖:
6楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-27 20:18:53:
嗯...........
1. 阙值还是不要手动调整了好，一般机子自行设定的都是比较可靠的，你若没有一定的定量知识就不要手动调整。你也可选择输出实验结果的荧光值，按照LinRegPCR软件计算后进行Ct矫正输出，不过这里只 ...

好的，谢谢，学习中
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orchid
7楼2012-03-27 20:38:10
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可帅儿

银虫 (正式写手)
★
西瓜: 金币+1, 祝福下~你是来倒苦水的么……不如发个帖，把问题仔细描述下吧。偶保证去捧场哈^_^ 2012-03-28 11:26:22
LZ我也是最近在做荧光PCR，也是跑不出结果。。。纠结啊
我怀疑我的反应体系不够标准，还有模板量不足这样的~唉继续研究吧
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
8楼2012-03-28 10:35:08
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lanhuaorchid

金虫 (著名写手)

orchid
引用回帖:
8楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-03-28 10:35:08:
LZ我也是最近在做荧光PCR，也是跑不出结果。。。纠结啊
我怀疑我的反应体系不够标准，还有模板量不足这样的~唉继续研究吧

一起加油吧，应该就是体系和程序的问题
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orchid
9楼2012-03-29 19:46:41
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lanhuaorchid

金虫 (著名写手)

orchid
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-27 16:19:08:
嗯.............
Bio-Rad 的CFX本人非常讨厌，有很较强的边缘效应（我本人也对伯乐的东西有偏见、抱歉）
请问你这个做的是标曲吗？有详细内容了我们才方便参谋参谋

另外请问，我的标品是质粒，A260/A230在1.4到1.6之间，太小了，怎么处理呢，谢谢
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orchid
10楼2012-04-01 22:55:48
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