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lanhuaorchid金虫 (著名写手)
orchid
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[求助]
有关定量PCR，急急急
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最近做了好久的定量ＰＣＲ，耗费了不少试剂，但没什么结果，求助…… 我是在文献里面找的引物，在普通ＰＣＲ仪上扩的很好，也摸了退火温度的，特异性也挺好的，扩增片段１００－３００之间，但在ＱＰＣＲ仪（伯乐的ＣＦＸ９６）扩增曲线很不好，要么就是只有最高的几个浓度有信号，要么就是Ｃｔ值基本都大于３０，改变退火温度也没有好转，也尝试了改为３步法，没有好转，但从头至尾熔解曲线都较好，想问问群里的大侠，有没有做这方面精通的，望能指点一二，实验各种悲剧呀  ，急急急还有同学的定量ＰＣＲ会出现这样的曲线（不好选择ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ），求解释  定量ＰＣＲ扩增曲线 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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atlanticwi
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西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-03-28 10:14:23
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嗯............. Bio-Rad 的CFX本人非常讨厌，有很较强的边缘效应（我本人也对伯乐的东西有偏见、抱歉） 请问你这个做的是标曲吗？有详细内容了我们才方便参谋参谋  |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
lanhuaorchid2楼2012-03-27 16:19:08
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感谢参与，应助指数 +1
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西瓜: 编辑内容 2012-04-02 11:14
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3楼2012-03-27 16:31:15
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atlanticwi
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【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good！ 2012-03-28 10:16:18
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嗯........... 1. 阙值还是不要手动调整了好，一般机子自行设定的都是比较可靠的，你若没有一定的定量知识就不要手动调整。你也可选择输出实验结果的荧光值，按照LinRegPCR软件计算后进行Ct矫正输出，不过这里只是针对相对定量的应用。 2. 边缘效应是指机子的温度控制越到靠边的行或排就越控制不准，偶用CFX96（学校的新机），每次最右边一列就毛都扩不出来，内参也一样，其他都能正常扩增。 3. 按你说的有调出5cycle有信号的这种，基本是不可能出现的，因为一般的Ct在20到35左右才是正常情况。 4. 你自己实验中说的按照文献的引物来做，但还包括反转录、试剂等等各方面的差异因素，不能说就一定重复出来，这个范围太广，不好提出建议 希望有所帮助 |
6楼2012-03-27 20:18:53
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7楼2012-03-27 20:38:10
LZ我也是最近在做荧光PCR，也是跑不出结果。。。纠结啊8楼2012-03-28 10:35:08
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9楼2012-03-29 19:46:41
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10楼2012-04-01 22:55:48
