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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 套叠PCR
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[求助] 套叠PCR

我想把基因内部的一段序列突变掉，采用套叠PCR的方法，两段PCR回收的大小分别为1400bp和200bp左右，但将这两段回收产物混合后作模板进行套叠，却怎么也扩不出目的带，请问是什么原因啊？我是大概按照浓度比1：1混合的，并且也试过不同体积的混合，结果都是一样，片段在250bp稍往上一点
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2012-03-27 12:38:44
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回帖置顶 ( 共有4个 )

to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, Good! 2,3点正解！！ 2012-03-29 17:37:49
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！我试着换下引物 2012-03-30 16:00:24
1.不是浓度比，是摩尔比1:1。
2.扩不出来是因为第二轮使用的引物就是第一步扩增这两个片段的上游和下游引物。在第二轮扩增时，引物与模板的结合因为“顶头”结合，所以结合效率降低，导致扩增效果受影响。
3.可以尝试第一轮扩增时使引物外延一段，第二轮扩增使用现在的引物，同时调整退火温度，使引物更好的结合模板，就可以解决此问题了。
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生活是面镜子~
12楼2012-03-29 01:24:04
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果子么么茶

木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-29 17:38:07
西瓜: 回帖置顶 2012-03-29 17:49:39
引用回帖:
10楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-28 22:53:30:
得到的两个片段一个1400左右，一个200左右，浓度差不多。不加引物先循环是怎么回事，是将它们混合后作模板，不加引物配好体系按正常PCR程序进行15－20个循环，然后再拿出来加引物扩增吗？这样可以吗，你做过没

先对照marker 计算出质量浓度后 换成摩尔浓度 1:1  
不加引物先循环是让两个片段互为引物扩增 使重叠区更好的搭桥 得到特异性扩增 之后扩增更好将全长扩出 我试过 但引物问题 没有扩出来 此做法有相关文献报道 不一定15-20 循环 可以少些
重叠PCR能成功 有效退火很重要 可以尝试 TOUCHDOWN PCR
还有 你的重叠区是13bp？ 好短 能搭桥的上吗？
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13楼2012-03-29 09:27:22
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good！ 2012-03-29 17:39:09
西瓜: 回帖置顶 2012-03-29 17:49:49
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 这个方法我试试，谢谢 2012-03-30 16:03:36
首先，加入的模板量的比例应该是摩尔比为1:1，其次，可以先不加上下游引物而让这两个片段搭到一起的那段为彼此的引物进行10个循环的扩增，然后再加入上下游引物扩增20个循环，如果还没有p出来的话，可以在不加引物的那十个循环里采取两步pcr的方法，我刚做了over lap pcr，2000bp的片段跟1000bp的片段一起搭，就是通过两步pcr做出来的，三步法压根没戏。
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14楼2012-03-29 11:53:40
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 很热心哈！祝试验成功~ 2012-03-29 17:50:45
小猫三两只: 金币+3, ★★★很有帮助, 我重新再做一遍看看 2012-03-30 16:01:30
引用回帖:
17楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-03-29 15:49:17:
“我一般把第二片段的上游引物的反向互补直接加到第一个片段的下游引物5‘端，所以overlap大概40bp左右。”按照你的做法，难道我引物设计的有问题？我的第一个片段的下游引物和第二个片段的上游引物是完全反向互 ...

首先，如12楼所说重叠延伸第一步是顶头结合，结合效率比正常的低，所以应该适当设计得长点。比如我们实验室就有人以片断为模版，打算通过两次加tail pcr最终使得片断前加了一两百bp。在第二次加tail pcr时，改了很多条件怎么p都p不出来，后来还是先把第一次加tail产物连在载体上，以载体做模版才p成功。个人认为之前之所以不成功就是因为顶头结合的原故，以载体为模板就避免了这个问题。当然重叠延伸肯定不能通过这种方式避开，但可以加强overlap的结合强度。至于你实验室前人有做过成功了，但你们的overlap又不一样，结合强度又不单看碱基个数，还有gc含量、分步，以及所形成二级结构也是会影响的。
其次，你分别p那两个片段的时候，最后一步72度设置了多长时间？这一步确保片断末端完整性，所以也可以适当延长点，我一般都设10min，有时不急着用的话设个20min。不过这步应该也影响不大。估计还是重叠延伸第一步时出了问题。
以上个人浅见，仅供参考。晚上也要做第三个重叠延伸，然望一次就通过哈
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
18楼2012-03-29 17:41:58
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖提供有帮助的信息！ 2012-03-27 19:17:27
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结合等等，爱莫能助！
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
2楼2012-03-27 13:12:15
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普通回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2012-03-27 13:12:15:
你说的应该是重叠延伸PCR吧，第二步PCR的确比较难P，原因也多种多样，我看你还是在退火温度上琢磨一下吧，试试梯度之类的……这个P不出来的具体原因实在是很难分析，原因太多。重叠部分过短，重叠部分有非特异性结 ...

是一个基因内缺失一段，用的基因内引物就把缺失的那段跨过去，扩增出两段后，再用全长基因的上下游引物，PCR混合产物作模板扩增。梯度我也试过，没什么效果
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3楼2012-03-27 15:50:13
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敏敏8305

铜虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 应助指数-1, 希望以后不应助的话，不要点应助哦 2012-03-29 10:26:22
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗？
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My heart will go on!
4楼2012-03-27 18:10:25
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 敏敏8305 at 2012-03-27 18:10:25:
请问楼主是做关于噬菌体展示技术方面的吗？

呵呵，不是的，就是研究基因的功能，缺失掉一段看基因功能有没有变化
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5楼2012-03-27 20:52:10
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很可能是引物设计的问题....不知道你要删去的片段有多大（几个氨基酸还是大片段），还有你删去片段的具体方法...所以原因不太好说。
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6楼2012-03-28 13:32:28
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lincy2010

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助哦 2012-03-29 10:26:44
这里的浓度比1:1是质量浓度还是摩尔浓度？应该要用摩尔浓度，因为发现你的两个片段大小相差较大。不过我之前做重叠延伸也没测浓度，看跑胶亮度差不多，切胶回收后按体积比1:1加的。不过估计问题应该不是出在这里，要看你设计的overlap多长，我一般把第二片段的上游引物的反向互补直接加到第一个片段的下游引物5‘端，所以overlap大概40bp左右。做了两次重叠延伸都没问题，现在准备做第三个
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耐得住寂寞，方能遇见繁华
7楼2012-03-28 15:09:17
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-29 10:26:58
小猫三两只: 金币+2, ★有帮助, 谢谢，我试试 2012-03-30 16:04:31

考虑模板浓度，重叠长短是否合适后
扩增之前不加全长引物，让其反应15-20个循环充分搭桥后，再加引物进行全长扩增，不知道你试过没
good luck！
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8楼2012-03-28 19:34:52
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-28 13:32:28:
很可能是引物设计的问题....不知道你要删去的片段有多大（几个氨基酸还是大片段），还有你删去片段的具体方法...所以原因不太好说。

中间去掉十几个氨基酸，就是用基因的上游引物作上游，在跨过这缺失的片段处的上下分别选择10几个碱基共20多个碱基作下游扩增得到第一个片段 ，同样再以这样的方法，以基因的末端作下游引物扩增得到第二个片段，再以这两个片段混合后作模板，用基因的全长引物扩增
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9楼2012-03-28 22:50:35
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 果子么么茶 at 2012-03-28 19:34:52:

考虑模板浓度，重叠长短是否合适后
扩增之前不加全长引物，让其反应15-20个循环充分搭桥后，再加引物进行全长扩增，不知道你试过没
good luck！

得到的两个片段一个1400左右，一个200左右，浓度差不多。不加引物先循环是怎么回事，是将它们混合后作模板，不加引物配好体系按正常PCR程序进行15－20个循环，然后再拿出来加引物扩增吗？这样可以吗，你做过没
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10楼2012-03-28 22:53:30
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